链霉菌CaiF1产抗菌物质的分离纯化及结构鉴定

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抗生素作为一类具有杀灭或抑制微生物成长的物质,已广泛应用在医院的各个科室,各种病症。放线菌是产生抗生素的主要微生物,其中又以链霉菌产生抗生素的数量最多、种类最丰富。本研究选用广东韶关大宝山禾本科植物根际土壤中分离纯化获得的链霉菌(Streptomyces sp)CaiF1为试验材料,通过设计针对性的实验,了解其生理生化特性,对链霉菌CaiF1进行种群鉴定,并对其所产抗菌物质进行分离纯化和结构鉴定。其结果如下:  1、链霉菌CaiF1产生的代谢活性产物能够排斥亚甲基蓝染色剂,能够与Dragendorff试剂发生阳性反应。其生理生化特征及16SrRNA序列分析结果显示,链霉菌CaiF1与白孢亚群的枝链霉菌(streptomuces rameus)相似度很高,但两者产生的活性物质不同,部分形态特征及生理生化特征也存在差异。链霉菌CaiF1被鉴定为链霉菌属,白孢链霉菌类群,白孢亚群,枝链霉菌的一个变种,或者新种。经SDS-PAGE电泳得到分子量约为14KD和4.2KD的两条带。其发酵液中能够产生抗菌活性物质,为抗生素类物质。  2、链霉菌CaiF1发酵液成份复杂,从发酵液中分离纯化抗生素,是抗生素新药研发的难点,也是本实验能够顺利进行的关键。其发酵上清液能够抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及酵母菌,对抗菌活性物质的物理与化学性质进行初步判定,采用乙酸乙酯萃取,AB-8大孔吸附树脂吸附,紫外光谱扫描,D152弱酸性阳离子交换树脂交换层析,硅胶柱层析和制备型高效液相色谱(HPLC),真空旋转蒸发等分离技术纯化抗菌物质;并以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为指示菌进行活性检测。结果从土壤链霉菌CaiF1发酵液中获得纯度99.86%的活性物质,产率为0.78mg/mL,为白色或类白色粉末,并具有强烈的抑菌活性。  3、本实验对链霉菌CaiF1发酵液中抗菌活性物质进行溶解性、抗菌谱、酸碱稳定性、光稳定性、热稳定性、毒性效应及草莓白粉病防效等进行研究。结果纯化样品易溶于水,有吸湿性,不溶或难溶于有机溶剂,是一种极性较大的水溶性物质;对大多数革兰氏阳性、阴性细菌有良好的抑制作用,抗菌谱与卡那霉素基本相同;但对酵母菌类真菌抑制效果较卡那霉素强,具有广谱抗性;在pH2.0-pH10.0、100℃、和紫外照射24h条件下抑菌活性几乎不变,经120℃处理1h后,其抑菌活性降低了20.85%;通过腹腔注射进行毒性检测,初步确定引起0%和100%死亡率剂量的所在范围为0.25g/mL-0.75g/mL,平均最小致死量为10.0367±0.0603g/kg;在喷洒样品培养一星期后,样品对草莓白粉病的防治效果最高可达69.7%。  4、对链霉菌CaiF1所产抗菌物质进行结构鉴定,利用SDS-PAGE蛋白电泳,氨基酸分析仪分析、原子吸收分光光度法,核磁共振以及光谱-质谱法对纯化样品进行结构解析。结果纯化样品不含任何氨基酸,不是蛋白或多肽类物质,不含有金属元素,经高分辨杂交质谱仪鉴定其荷质比m/z=485.24,样品分子量为484.24,分子式为C18H37O11N4,与卡那霉素A、C相同。并对其二级结构进行验证,确定土壤链霉菌CaiF1所产抗菌物质为氨基糖苷类抗生素中卡那霉素类抗生素。
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