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近年来对碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌（Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae,CRE）不断出现,给临床治疗的用药选择带来了巨大挑战。本研究旨在了解肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的药物敏感性变迁;确定CRE菌株的产酶情况和科室分布情况,深入分析产碳青霉烯酶的大肠埃希菌的耐药机制及播散机制,判断瑞金医院内否存在暴发流行;针对少见的碳青霉烯类基因进行专门的研究,分析其耐药特性、流行情况及可能的传播途径;最终整体了解上海地区CRE菌株的产酶及流行情况,为合理用药及采取及时有效的防控措施提供依据。本研究共包含以下四部分内容:第一部分:瑞金医院CRE中碳青霉烯酶的基因型检测收集整理上海交通大学附属瑞金医院自2000年1月到2014年12月临床微生物科所有从临床标本中分离得到的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的药敏试验结果,运用软件WHONET 5.6进行统计分析发现,自2009年后,瑞金医院肺炎克雷伯菌对包括碳青霉烯类抗生素在内的多种抗生素敏感率持续下降,且下降速度有不断加快的趋势。2000年以来,大肠埃希菌对头孢类抗生素,敏感性下降明显,对碳青霉烯类抗生素仍保持高度敏感,对阿米卡星的敏感性有缓慢上升的趋势。收集瑞金医院自2010年4月至2015年1月临床筛选分离得到的199株对碳青霉烯类抗生素不敏感的肠杆菌科细菌,经过PCR扩增常见的碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaIMP、blaOXA-48、blaVIM、blaNDM、blaSME、blaIMI),对扩增产物进行测序比对分析,共得到124株产碳青霉烯酶菌株。其中,肺炎克雷伯菌61株,大肠埃希菌39株,其他细菌共24株。其中产KPC-2酶88株,IMP酶19株,NDM酶15株,IMI酶2株。科室分布广泛,44株产酶菌分离自ICU病人标本。第二部分产碳青霉烯酶的大肠埃希菌传播机制研究及流行病学调查自2011年至2014年临床筛选分离得到的21株对碳青霉烯类抗生素不敏感的大肠埃希菌中,经PCR扩增确定16株产碳青霉烯酶大肠埃希菌。其中13株产KPC-2酶,3株产IMP-4酶。经Etest法确定其最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration,MIC）证实所有菌株对碳青霉烯类、头孢菌素类、环丙沙星及氨曲南均耐药,对阿米卡星和哌拉西林/他唑巴坦的耐药率分别为43.8%和87.5%。通过多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing,MLST）确定11株菌产KPC-2酶的大肠埃希菌为ST131型,其中9株同时为H30亚型。根据脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis,PFGE）将其共分为9型（A-G）,其中A型9株,F型2株,其余各型分别1株。10株样本成功进行接合试验,经S1-PFGE和Southern杂交试验证实10株菌中blaKPC-2基因由IncFII质粒携带,质粒大小从55 kb到160 kb不等,三株携带blaIMP-4酶的IncN质粒大小均为50 kb左右。第三部分NDM-5型碳青霉烯酶在肠杆菌科细菌中的检测及其传播机制研究我们共收集到4株产NDM-5酶的细菌,分别为肺炎克雷伯菌1株,变形杆菌1株,大肠埃希菌2株。经Etest法确定肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌对碳青霉烯类、三代头孢菌素类及哌拉西林/他唑巴坦耐药,但对阿米卡星敏感。两株大肠埃希菌经MLST鉴定分别为ST453和ST156型,PFGE结果差异大,肺炎克雷伯菌为一个全新的分型,ST2250。2株菌接合转移试验成功进行且耐药基因均由一个约40 kb左右的IncX3质粒携带,1株菌耐药基因由一个约180 kb左右的IncX3质粒携带,另1株菌则由一个约30 kb大小的IncFII质粒携带。经PCR扩增发现4株产酶菌拥有相同的blaNDM-5基因环境,依次为IS3000、ISAba125Δ、IS5、blaNDM-5、bleMBL、trpF、dsbC、cutA1Δ、IS26、umuDΔ。第四部分IMI型碳青霉烯酶在肠杆菌科细菌中的检测及遗传特征研究用Etest法对产IMI-2酶的大肠埃希菌和IMI-3酶的解鸟氨酸拉乌尔菌进行药敏试验,证实2株菌对亚胺培南的耐药程度要比厄他培南和美罗培南高,而对广谱β内酰胺类抗生素、阿米卡星及环丙沙星敏感。S1-PFGE和Southern杂交试验表明大肠埃希菌中blaIMI-2基因由一个约170kb左右的FIB质粒携带,解鸟氨酸拉乌尔菌的耐药质粒pRJ46C成功进行接合试验,质粒全测发现该质粒大小为166,620 bp,GC含量为52.8%,共含有193个开放阅读框,耐药基因blaIMI-3存在于一段长约15 kb一个全新的转座子上,即Tn6306。综上,肠杆菌科细菌尤其是肺炎克雷伯菌近年来对碳青霉烯类抗生素的敏感率菌下降明显,肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌是CRE菌株的主要组成部分。产生碳青霉烯酶是上海地区CRE菌株的主要耐药机制之一,其中以KPC-2酶为主,IMP酶和NDM酶次之。瑞金医院同时存在着产碳青霉烯酶的大肠埃希菌的水平传播和克隆传播,ST131型H30亚型是产KPC酶大肠埃希菌的主要流行类型。我们首次在变形杆菌中检出NDM-5酶,并首次在国内的解鸟氨酸拉乌尔菌和大肠埃希菌中检出IMI酶,标志着两种酶在肠杆菌科细菌中进一步的传播,IncX3质粒在blaNDM-5基因的传播过程中可能扮演了重要角色,一个新型的携带有blaIMI-3基因的转座子,Tn6306,可能介导了blaIMI-3的水平传播。