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灰霉病(gray mold)由葡萄孢属真菌(Botrytis spp.)和类似葡萄孢属真菌(Botrytis-like fungi)引起。利用分子检测的方法预测果蔬灰霉病菌以及鉴定病原种类是一种快速便捷的手段。前期研究已经明确大部分果蔬灰霉病病原种类,但大多数植物灰霉病菌都缺乏特异性分子检测和鉴定体系。针对上述问题,本研究以蚕豆赤斑病病原,葱属作物灰霉病病原,葡萄灰霉病病原为材料,研究其分子检测及鉴定方法。获得了以下研究结果:1.建立了区分蚕豆上三种葡萄孢属真菌(灰葡萄孢Botrytis cinerea、蚕豆葡萄孢B.fabae和拟蚕豆葡萄孢B.fabiopsis)的分子标记及检测鉴定方法。采用RAPD和SCAR标记技术分别获得了检测和鉴定B.cinerea和B.fabiopsis的特异PCR引物Bc-f/Bc-r和Bfab-f/Bfab-r。利用NEP1基因序列(编码坏死及乙烯诱导蛋白1)设计出检测和鉴定B.fabae的特异PCR引物对Bfa-f/Bfa-r。这三对引物能在单独PCR扩增及混合PCR扩增的条件下扩增出相应种葡萄孢的基因组DNA,呈现出高度特异性。在25μL的PCR反应体系中,三对引物的灵敏度分别为:B.fabae 40 pg DNA、B.fabiopsis 40pg DNA和B.cinerea 400 pg DNA。当PCR反应体系中蚕豆DNA和Botrytis DNA重量比达到1000:1(w/w)时,不影响三对引物对目标Botrytis的检测。同时,多重PCR能检测出人工接种叶片和田间叶片中的3种葡萄孢。以上结果显示,本研究开发的多重PCR方法能被用来检测和鉴定蚕豆赤斑病菌。2.建立了区分葡萄上四种葡萄孢属真菌(灰葡萄孢Botrytis cinerea、假灰葡萄孢B.pseudocinerea、中国葡萄生葡萄孢B.sinoviticola和未定名种Botrytis sp.2)的分子标记及检测鉴定方法。采用RAPD和SCAR标记技术分别获得了检测和鉴定B.cinerea、B.pseudocinerea、B.sinoviticola和和Botrytis sp.2的特异PCR引物对Bc-f/Bc-r、Bps-f/Bps-r、Bsa-f/Bsa-r和Bsp2-f/Bsp2-r。这四对引物在单独PCR扩增的条件下能扩增出相应葡萄孢种的基因组DNA,呈现出高度特异性。在25μL的PCR反应体系中,四对引物的灵敏度分别为0.7 ng B.pseudocinerea DNA、0.7 ng B.sinoviticola DNA、0.7 ng Botrytis sp.2 DNA和400 pg B.cinerea DNA。同时,单对引物PCR能检测人工接种叶片中的4种葡萄孢。3.建立了区分葱属植物上六种葡萄孢属真菌(葱腐葡萄孢B.aclada、葱细丝葡萄孢B.byssoidea、灰葡萄孢B.cinerea、大蒜盲种葡萄孢B.porri、葱鳞葡萄孢B.squamosa和中国葱葡萄孢B.sinoallii)的分子标记及检测鉴定方法。采用RAPD和SCAR标记技术分别获得了检测和鉴定B.cinerea、B.aclada、B.byssoidea、B.porri、B.squamosa和B.sinoallii的特异PCR引物对Bc-f/Bc-r、Bac-f/Bac-r、Bby-f/Bby-r、Bpo-f/Bpo-r、Bsq-f/Bsq-r和Bsi-f/Bsi-r。这六对引物在单独PCR扩增的条件下能扩增出相应葡萄孢种的基因组DNA,呈现出高度的特异性。在25μL的PCR反应体系中,六对引物的灵敏度分别为0.07 ng B.aclada DNA、0.07 ng B.byssoide DNA、7 pg B.porri DNA、7 pg B.sinoallii DNA、7 pg B.squamosa DNA和400 pg B.cinerea DNA。同时,单对引物PCR能检测出人工接种叶片中的6种葡萄孢4.以Botrytis属及其近缘属32个种共63个菌株为材料,探讨了ITS及三个核基因(G3PDH、HSP60和RPB2)作为Botrytis属DNA条形码的可能性。通过分析Botrytis种间和种内的差异以及系统发育树聚类结果,选定G3PDH基因的部分序列作为Botrytis属DNA条形码,同时设计获得DNA条形码PCR引物G31-f/G31-r扩增Botrytis属及其近缘属真菌,均能产生789 bp~798 bp大小的片段。测序结果显示:扩增得到的DNA片段可以区分不同种葡萄孢。由此证实G3PDH基因部分序列可以用于区分葡萄孢属真菌的DNA条形码。本研究获得的PCR引物及DNA条形码序列将有助于快速检测和区分不同葡萄孢种类。为进一步研究植物灰霉病菌的群体生物学和流行动态奠定了基础。