研究背景： 1.原发性肝癌的治疗现状 原发性肝癌是临床上最常见的消化系统恶性肿瘤之一，其中90％为肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。在欧美国家，肝癌是第5位常见的恶性肿瘤；而在中国及东南亚等地区其发病率更高，其死亡率为恶性肿瘤的第2位，甚至第1位。在我国每年约有29.3万人死于肝癌，占全球肝癌死亡人数的58.5％。目前，在世界范围内，其发病率亦呈上升趋势。行手术切除仍然是肝癌首选的、最有效的治疗方法，关键是在于早期诊断；但是大多数的患者在发现时已属中、晚期，失去手术的机会，预后差。目前，肝动脉化疗栓塞、肝动脉或门静脉灌注化疗等治疗方法常可使肿瘤缩小，使部分病人可因此获得二期手术切除的机会。但化疗药物在杀死癌细胞的同时也对体内的正常细胞造成损害，这是目前肝癌化学等治疗的一个瓶颈问题，临床医生亟需寻求一种新的有效治疗方法。 2.肿瘤的生物导向治疗现状 生物导向治疗是近年来肿瘤医学发展的趋势，其中的放射免疫治疗更是研究的热点之一。目前，已有多种抗肿瘤抗体获得美国FDA的批准，动物实验及初步的临床应用结果令人鼓舞。但是，由于用于临床研究的绝大多数都是鼠源性单克隆抗体(monoclonal antibody，MAb)，产生人抗鼠抗体(human anti—mouse antibody，HAMA)反应，影响治疗效果甚至引发严重的毒副反应。另外，由于完整抗体的大分子结构，使其难于穿透组织到达靶细胞，严重限制了它的应用及发展。 近年来，基因工程技术的发展为解决上述问题带来了希望。如对鼠单抗恒定区的人源化(人-鼠嵌合抗体)、可变区的人源化(人改型抗体、对表面氨基酸残基的人源化、通过抗体库技术人源化等)，亦有一些研究用F(ab)2，Fab’等抗体片段代替完整抗体分子，均取得了一定成果，但仍存在较多问题。 单链抗体(single chain fragment of variable，scFv)，作为一种新的基因工程抗体，是目前抗体工程的研究热点。它是由抗体的重链可变区和轻链可变区通过一段连接肽(linker)连接而成的重组蛋白，是具有完全抗原结合位点的最小抗体片段，大小为完整抗体分子的1/6，肿瘤穿透力强，避免了抗体Fc段引起的非特异性细胞毒性及免疫原性，并且易于基因操作和基因工程大量生产。 近年来，有关抗人肝细胞肝癌单链抗体的研究虽时见报道，并已取得了一定的成绩，但由于特异性不高及抗原异质性等原因限制了其进一步的应用。因此，积极制备新的抗肝细胞肝癌单链抗体是必要的，为原发性肝癌的生物导向治疗、放射免疫治疗和免疫载药纳米的导向治疗打下基础，对有效地减少中晚期肝癌患者的肿瘤负荷以增加二期手术机会，提高患者的生存期及生活质量，具有重要的临床意义。 本课题分为两个部分：1、抗人肝细胞肝癌单克隆抗体的制备及其生物学特性的初步鉴定：2、抗人肝细胞肝癌单链抗体基因的构建及其表达。 第一部分:抗人肝细胞肝癌单克隆抗体的制备及其生物学特性的初步鉴定 目的：制备高特异性、高亲和力的抗人肝细胞肝癌(HCC)的单克隆抗体(MAb)，为原发性肝癌的生物导向治疗、放射免疫治疗和免疫载药纳米的导向治疗奠定基础。 方法：用人肝癌细胞株HepG—2和SMMC—7721分别经多种途径免疫BALb/c小鼠，取其脾脏细胞与同源小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14融合，经筛选培养、ABC免疫组化法初筛抗体、有限稀释法亚克隆化、染色体分析、免疫组化鉴定抗体特异性、共聚焦显微镜扫描技术(LCSM)进行组织定位、ELISA分析鉴定抗体的亚型等进一步鉴定其生物学特性。 结果：经“尾静脉+脾脏联合免疫”方法获得一株分泌抗人肝细胞肝癌单克隆抗体的杂交瘤，经4次亚克隆化体外培养7个多月，仍能稳定地分泌单克隆抗体，其染色体为103±5条，并含1～2条中着丝点标志染色体，该抗体与肝癌组织结合的特异性高达98.5％(67/68)，阳性部位主要定位在肝癌细胞膜及胞浆上，此抗体属小鼠IgM型。 结论：“尾静脉+脾脏联合免疫方法”能有效刺激脾脏细胞的增殖，同时大大缩短免疫循环周期，提高杂交瘤制备的成功率；制备了一株分泌小鼠IgM型抗人肝细胞肝癌单克隆抗体的杂交瘤，其肝癌组织特异性高，阳性部位主要定位在肝癌细胞膜及胞浆上，有着良好的靶向性，对肝细胞肝癌有潜在的诊断及生物导向治疗作用。 第二部分:抗人肝细胞肝癌单链抗体基因的构建及其表达 目的：构建抗人肝细胞肝癌单链抗体scFv，并在HeLa细胞中表达，为进一步探索原发性肝癌的生物导向治疗、放射免疫治疗和免疫载药纳米的导向治疗奠定基础。 方法：从分泌抗人肝细胞肝癌单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞中提取总RNA，采用针对小鼠Ig家族的混合引物，应用RT—PCR技术扩增该抗体的VH和VL基因，回收并重组入pGEM—T easy克隆载体上进行测序。根据测序结果，设计特异性引物，引入连接肽linker(Gly4Ser)3，扩增VH和VL并将其连接成具有VH—linker—VL结构的ScFv基因，将其重组入pGEM—T easy克隆载体进行测序。将pGEM—T easy/scFv中的scFv基因片段经酶切、连接等反应，亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体的相应位点，酶切鉴定后，将重组体pcDNA3.1/scFv转染入HeLa细胞中表达，表达产物纯化后，采用SDS—PAGE电泳、Western blot及免疫组化法进行鉴定分析单链抗体scFv的特异性及活性。 结果：计算机分析显示VH和VL均符合小鼠抗体可变区的特征；序列分析证实在pGEM—T easy载体上以(Gly4Ser)。连接肽成功构建了抗人肝细胞肝癌的scFv单链抗体基因，该scFv基因大小为687bp；SDS—PAGE电泳、Western blot及免疫组化分析表明该scFv单链抗体在HeLa细胞中成功表达，表达蛋白分子量约为25kD，表达产物可特异性识别及结合肝癌细胞，而不与正常正常肝脏细胞及其他恶性肿瘤组织结合，很好地保存了亲本单克隆抗体的肝癌特异性及抗体活性。 结论：构建了抗人肝细胞肝癌的scFv单链抗体基因，并在体外真核细胞表达系统中实现了scFv的有效表达，分析证实scFv较好地保留了其亲本抗体的特异性和亲和力，为肝细胞肝癌的导向治疗奠定了基础。