内皮抑素(Endostatin,ES)是一个分子量为20kDa的多肽,最早是从小鼠血管内皮瘤中分离出来的,成为首个被发现的内源性抑制血管新生的细胞外基质片段,同时也是被研究最多的内源性血管新生抑制剂。ES中有一段可高效抑制内皮细胞增殖、迁移的序列ES2(60-70,IVRRADRAAVP),其体内抑制新生血管生成的活性约为完整ES序列的3倍。Anti-fltl肽(GNQWFI,AF)是从位置扫描合成肽组合文库中通过一个包含纯化的重组VEGF及嵌合受体的扫描系统遴选出来的一种VEGFR1选择性的六肽。AF肽可特异地与VEGFR1结合,从而抑制VEGFR1与一系列配体,如VEGFA、VEGFB、PIGF等的相互作用。与其他VEGFR1的单克隆抗体或RNA拮抗剂不同,AF肽是一种能够通过较低生产成本简易合成的非免疫原性的六肽,这些优点决定了其适合在临床应用,但是存在水溶性较差的缺点。透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是一种从牛眼玻璃体中发现的、带负电荷的、非硫酸化的线性糖胺聚糖,重复二糖单元为β-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸,其生物可降解和高载药性的特点使其广泛应用于医药领域。HA可通过与细胞及细胞间质的受体作用调节肿瘤细胞侵袭、肿瘤细胞的分化、成纤维细胞中病毒的转化、胚胎组织形成等过程。有四种HA特定受体存在于细胞膜表面——CD44、RHAMM(Receptor for HA-Mediated Motility)、IVd4 和 LEC,这之中在肿瘤部位表达较多的是CD44。AF和ES2在活性方面既有相似又有不同,如果将这两个肽的序列融合在同一个肽中,有望获得更好的生物活性、更好的稳定性和更长的半衰期。为此,我们设计了序列为IVRRADRAAVPGGGGGGNQWFI的肽链,将其命名为ES2-AF,并利用可以靶向肿瘤部位高表达的CD44受体的HA对其进行化学修饰,期待修饰后的多肽溶解性更好、靶向性更强、半衰期更长,从而更好的在体内更好的发挥抗新生血管生成作用。本课题研究内容和取得的主要成果如下:1..ES2-AF的合成与表征采用Fmoc固相合成方法合成了一种ES2-linker(GGGG)-AF肽,由高效液相色谱进行纯化,纯度均可达95%以上,并进行了结构的确证。2.HA-ES2-AF的合成与表征由于HA溶于水但不溶于有机溶剂,为了下一步的偶联反应,首先用四丁基氢氧化铵对其进行离子交换,形成可溶于DMSO的HA-TBA结合物。HA-TBA分子经卡特缩合剂(BOP)活化羧基后,与ES2-AF、DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)反应得到HA-ES2-AF结合物。经1H NMR核磁结果分析表明ES2-AF成功被HA修饰,连接率93.75%,平均每HA链上连结60个ES2-AF肽。3.ES2-AF与HA-ES2-AF的生物活性研究3.1 ES2-AF及HA-ES2-AF的体外抗新生血管生成活性研究(1)采用MTT法评价了抗内皮细胞增殖作用,ES2与ES2-AF在体外均具有抑制内皮细胞增殖的作用,并呈现随浓度增加的趋势。当ES2-AF浓度分别为5μg/mL、50 μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL、500μg/mL 时,其对内皮细胞增殖的抑制率分别为(11.37%±6.09%)、(13.63%±4.92%)、(17.61%±5.59%)、(16.74%±4.57%)、(27.49%士5.56%)。经 HA 修饰后的结合物 HA-ES2-AF 也在体外表现出了一定的抑制内皮细胞增殖的作用,当其肽浓度分别为表5 μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、5000μg/mL时,其对内皮细胞增殖的抑制率分别为(6.67%±4.92%)、(12.01%±8.13%)、(16.96%±5.23%)、(24.37%±8.97%)、(36.40%±7.65%)。(2)采用Transwell小室法测定了抑制内皮细胞转移的作用。以PBS作为空白对照,当药物肽浓度均为200 μg/mL时,AF、ES2与ES2-AF三组发生细胞转移的个数分别为(229±11)、(254±4)、(255±13)。AF、ES2 与 ES2-AF 三组药物对于内皮细胞转移都有一定的抑制作用,但是差异不大,说明三组实验药物对于肿瘤转移的抑制作用并没有很大差异。当肽浓度均为200μg/mL时,ES2-AF、HA&ES2-AF混合物、HA-ES2-AF结合物三组发生细胞转移的个数分别为(255±13)、(202±24)、(170±7),HA-ES2-AF 表现出了最强的抑制内皮细胞转移的作用,具体机制仍有待进一步研究。(3)利用管腔形成实验研究了 ES2-AF、HA-ES2-AF等对内皮细胞EAhy926形成血管的影响。用PBS作为空白对照,AF与ES2在各浓度时抑制体外内皮细胞管腔形成的作用相差不大,但ES2-AF对于内皮细胞管腔的形成的抑制作用明显高于AF和ES2。在肽浓度均为25 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL时,AF组的节点数分别为(99± 19)、(75± 17)、(63± 12),ES2组的节点数分别为(67± 14)、(72±3)、(61±5),HA-ES2-AF 组的节点数分别为(32±3)、(17±6)、(19±5)。由此可见,HA-ES2-AF对内皮细胞管腔形成的抑制作用在所有给药组中是最强的,说明利用HA对多肽的化学修饰提高了其抑制内皮细胞官腔形成的能力。(4)采用ELISA方法根据抗原抗体结合原理测定了 AF、ES2、ES2-AF及HA-ES2-AF对于VEGF及其受体VEGFR1(Flt-1)结合的抑制能力。ES2与ES2-AF均表现出比AF更强的抑制能力,其中ES2-AF的抑制作用略强于ES2。HA-ES2-AF在 5 μg/mL～200 μg/mL 范围内的相对值分别为(83.24%±0%)、(55.01%±0.07%)、(51.04%士0.09%)、(41.25%±0.01%)、(37.76%±0.03%),说明 HA-ES2-AF对VEGF及其受体VEGFR1(Flt-1)结合的抑制能力呈浓度依赖性提高。较高浓度时HA-ES2-AF抑制VEGF及其受体VEGFR1(Flt-1)结合的能力明显高于ES2-AF肽。3.2 ES2-AF及HA-ES2-AF的体内抗新生血管生成活性研究在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验中,与生理盐水组进行相比,AF在实验剂量下对CAM血管生成没有明显抑制作用;ES2-AF组在5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL时新生血管面积百分比分别为(32.03%±0.10%)、(22.84%±0.19%)、(19.26%±0.03%),表现出比ES2更高的体内抗血管生成的生物活性并呈现剂量相关。HA与ES2-AF混合物中HA的加入并没有对ES2-AF在动物体内的抑制CAM血管生成产生较大影响。而HA-ES2-AF组在5 μg/mL、25 μg吨/mL、50 μg/mL时新生血管面积百分比分别为(9.67%±0.03%)、(10.12%±0.01%)、(13.10%±0.04%),与ES2-AF及混合物组相比抑制CAM血管生成的活性明显提高。4.HA-ES2-AF的靶向能力研究4.1体外与CD44受体结合能力研究通过表面等离子共振(SPR)技术研究了 HA-ES2-AF在体外对肿瘤细胞表面受体CD44的结合能力。以HA为阳性对照,研究了 HA-ES2-AF、ES2-AF与CD44蛋白之间的相互作用关系。筛选合适的pH将CD44蛋白锚定于CM5芯片表面,使样品流过芯片,通过Biacore T200的分析软件得出以下三种样品与CD44蛋白结合的 KD值:HA 为 4.198×10-11 mol/L,HA-ES2-AF 为 4.779×10-10mol/L,ES2-AF为3.011×10-4mol/L,即样品与CD44结合能力的排列顺序为:HA>HA-ES2-AF》ES2-AF,经过HA的修饰HA-ES2-AF结合物对细胞表面受体CD44的结合能力较修饰前的肽有十分显著的提升,具有潜在的体内肿瘤部位靶向能力。4.2体内组织分布研究通过活体成像技术研究了 HA-ES2-AF在体内组织分布情况。将ES2-AF与HA-ES2-AF用FITC标记,分别给药于荷黑色素瘤裸鼠,采用小动物活体成像仪进行拍照记录。通过比较发现HA-ES2-AF-FTIC在裸鼠体内分布代谢时间较长,即HA-ES2-AF-FITC的体内血浆半衰期较长,证明了化学修饰有助于增强多肽的稳定性,这与后面药代动力学实验的结果一致;分布于肿瘤部位的药物增多,表明经HA修饰的ES2-AF-FITC在荷瘤裸鼠体内对于肿瘤部位有一定的靶向性,证明了糖基化修饰有助于提高多肽的靶向分布能力,这与SPR实验的结果相符合。5.HA-ES2-AF的药代动力学研究本实验选用Wistar大鼠作为体内药物代谢动力学的模型,通过比较药代动力学参数发现,与ES2-AF相比,HA-ES2-AF在大鼠体内的循环时间明显延长,半衰期由2.79 h延长至18.07 h,平均滞留时间MRT由4.68 h增加至13.18 h,药时曲线下面积AUC0-∞也由2887.80 mg/L·h增大至10694.70 mg/L·h,血浆清除率CL也有所下降。较长时间的维持高血药水平有助于减少给药剂量或降低给药频率。本研究取得的成果和结论主要有:(1)成功固相合成了纯度在95%以上的ES2-AF肽,其体内外抗新生血管生成活性高于ES2或AF。(2)成功完成HA对ES2-AF的化学修饰及结构表征,平均每HA链上连结60 个 ES2-AF肽。(3)HA-ES2-AF表现出比ES2-AF和HA&ES2-AF混合物更强的抑制内皮细胞增殖与迁移的能力、更强的抑制VEGF与受体结合的能力,以及更强的抑制CAM新生血管生成的能力。(4)利用SPR和活体成像技术发现,HA-ES2-AF比ES2-AF具有更强的CD44结合能力,并表现出一定的体内肿瘤部位靶向性和更长的体内分布代谢时间。(5)HA-ES2-AF的体内半衰期是ES2-AF的6.48倍,有助于减少给药剂量或降低给药频率。