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栗疫病是由栗疫菌(Cryphonectria parasitica)引起的一种世界著名森林病害,在我国南北广大的各种板栗种植区均有不同程度的危害。目前主要通过化学措施控制板栗疫病,但长期和不合理地使用化学农药带来环境污染和引起病原菌产生抗药性等问题日益严重。因此,开发绿色、有效的替代防治手段尤其重要。本研究的目的是筛选对板栗疫病具有高效防病效果的拮抗菌,以全基因组测序为指导,CRISPR敲除体系为工具,探究其与抑菌活性相关的次级代谢基因簇,从而为生物防治板栗疫病菌剂的开发和应用提供高效生防菌株和前期理论基础。 本研究从多种植物和根际土壤中分离微生物菌种,得到96株对栗疫菌具有抑菌活性的拮抗菌,16S rRNA序列测序结果显示,这些菌株隶属于11个不同的属。其中有1株对栗疫菌抑菌效果很强的植物内生菌SAT1,该菌对栗疫菌的抑菌圈直径2.0±0.16cm。为评测其在生物防治方面的应用潜力,对菌株SAT1的抑菌谱、挥发性物质的抑菌效果、能否在板栗上定植等进行测定,结果显示SAT1是1株能够在板栗上定植、抑菌谱广、其非挥发性物质和挥发性物质对供试菌株产生明显抑菌效果的植物内生菌;SAT1含有聚酮合成酶编码基因和多烯类化合物聚酮合成酶编码基因,能产生IAA。基于培养特征、16S rRNA序列比对,将菌株SAT1鉴定为Streptomyces sp.SAT1。 通过第三代测序技术获得拮抗菌株SAT1的全基因组完成图,包括线性染色体7,472,530bp,GC含量73.15％;质粒Plas11095bp,GC含量75.80％;质粒Plas2343,282bp,GC含量72.38％;质粒Plas3840,523bp,GC含量73.34％;质粒Plas492,538bp,GC含量70.03％。共含有6个rRNA操纵元(18个rRNA基因)、21个sRNA基因和69个tRNA基因。基因组中共预测出7,550个蛋白编码基因,占整个基因组的86.11％。通过系统发育分析、泛基因组、噬菌体预测、基因簇预测和促生特征分析等方法将菌株SAT1与其他41个链霉菌基因组完成图进行比较分析,整个链霉菌类群表现出高GC含量(均大于70％)、基因组高杂合性等共性,每个基因组上有1-20个噬菌体碎片存在,大小跨度从5.1kb到74.9kb,是基因组杂合性高的重要原因之一;在解磷、膦途径、产铁载体途径和产IAA途径中,42株链霉菌均有一个或者多个关键基因分布其中,42个基因组完成图均含有20个到55个次级代谢基因簇,促生特征和次级代谢基因簇两个方面足以证明链霉菌应用于生物防治的巨大潜力。拮抗菌SAT1含有37个(15个大类)次级代谢基因簇,对比其他41株链霉菌的次级代谢基因簇,潮霉素B(Hygromycin_B)基因簇和默诺霉素(Moenomycin)基因簇为拮抗菌SAT1所特有,这两个基因簇可能为拮抗菌具有抑菌活性的重要原因。 为验证默诺霉素基因簇和潮霉素B基因簇在拮抗菌抑菌过程中的作用,通过CRISPR系统的质粒pCRISPomyces-2,构建敲除质粒,成功敲除约14kb潮霉素B次级代谢基因簇,得到突变株Streptomyces sp.SAT1(△ctg4_647-ctg4_660),通过平板对峙实验显示,突变型菌株相对于野生型菌株的抑菌圈宽度降低了约77％,说明潮霉素B基因簇在拮抗菌SAT1抑制栗疫菌的过程中起着重要的作用。 在筛选拮抗菌株的过程中,获得2株来自土壤的菌株,也对栗疫菌产生一定的拮抗效果。对这2株拮抗菌株9-2T和12-3T进行多相分类研究,最终确定为两个新种,分别命名为Halomonas heilongjiangensis sp.nov.和Bacillus lindianensissp.nov.,为栗疫菌的生物防治提供了土壤来源的新种资源。