论文部分内容阅读
产肠毒素大肠杆菌F18(E.coli F18)是引起断奶仔猪腹泻的主要病原菌,目前研究发现,E.coliF18受体合成通路和炎症免疫信号通路调控着断奶仔猪E.col F18的抗性。脂多糖结合蛋白(Lipopolysaccharide-bindingprotein,LBP)不仅能结合革兰氏阴性菌细胞壁主要成分脂多糖或内毒素(Lipopolysaccharide,LPS)激活免疫信号通路,从而杀死病原菌进而维护宿主内环境的稳态,而且血清中高浓度LBP能中和LPS,降低LPS的生物学活性,因此LBP是体内免疫防御机制中重要的组成部分。E.coliF18作为革兰氏阴性菌,LPS也是其重要的致病因子。因此,LBP基因可能在断奶仔猪E.coli F18抗性中发挥着重要的作用。本试验以梅山猪为试验材料,探究LBP基因在猪不同发育时期及不同组织中的表达规律,并探讨猪LBP基因甲基化及其对基因表达的调控机制,为了解LBP基因功能及今后更好的将其应用到猪抗病选育提供一定的试验依据和理论基础。1.本试验利用Real-time PCR检测了L P基因在35日龄梅山猪中的组织表达谱(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肌肉、胸腺、肠系膜淋巴结、十二指肠、空肠和回肠等12个组织);检测了其在不同发育时期(1、7、14、21、28、35和158日龄)梅山猪肝脏组织中的表达规律;利用不同浓度的LPS诱导猪肠上皮细胞(IPEC-J2),并分别在诱导后2h、4h和6h检测LBP基因在IPEC-J2细胞系中的表达。结果表明,LBP基因在肝脏组织中的表达极显著高于其他组织(P<0.01),在十二指肠组织中的表达水平显著高于除肝脏组织外的其他组织(P<0.05);除肝脏和十二指肠组织外,其他组织中LBP基因的表达水平较低且无显著性差异(P>0.05);LB 在1和21日龄肝脏组织中的表达极显著高于7、14、28和35日龄(P<0.01),158日龄肝脏组织中的LBP表达极显著高于28和35日龄(P<0.01),显著高于7和14日龄(P<0.05);不同浓度的LPS(0.1μg/mL、0.5μg/mL和1 μg/mL)诱导IPEC-J2细胞系后,各浓度LPS诱导后LBP的表达并未呈现一致的表达规律。本试验推测,猪LBP基因主要高度表达于肝脏组织中;肠道组织中一定程度也可合成分泌LBP;当仔猪受到外界病原菌或病原相关分子(Pathogen-associated molecular pattern,PAMP)侵染时,LBP基因的表达也会随之发生变化;肠上皮细胞可能并不是肠道组织中主要分泌和合成LBP蛋白的细胞系。2.本试验利用BDGP软件预测分析猪LBP基因核心启动子区,并基于预测结果设计缺失片段,利用双荧光素酶报告基因技术检测各片段的启动子活性。结果表明,梅山猪LBP基因启动子区段的-500～-206 bp为核心启动子区;-1500～-500 bp为调控猪LBP基因启动子活性的重要区段。3.本试验利用焦磷酸测序技术检测猪LBP基因核心启动子区的甲基化水平,其中在梅山猪不同组织中CpG2和CpG3位点的甲基化水平和LBP基因的表达呈现显著的负相关,线性相关系数分别为-0.4684和-0.3069;而在不同发育阶段的梅山猪肝组织中CpG2和CpG3位点的甲基化水平与基因表达并无显著的相关性。CpG2和CpG3位点的甲基化可能抑制转录因子YY1与启动子DNA序列的结合,从而导致猪LBP基因的组织表达差异,而外来病原菌及LPS进入仔猪体内可能是通过其他调控途径影响LBP基因的表达。