高糖对层粘连蛋白α1的表达及细胞生物学行为影响

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目的:  糖尿病性视网膜病变是糖尿病患者非常常见的微血管并发症,高血糖可以引起细胞外基质组份的增加,层粘连蛋白作为重要的细胞外基质组份之一,还参与基底膜和血管的构成,并通过细胞膜上的受体影响细胞的生物学行为,如细胞的粘附、迁移、增殖等,而其中α链是层粘连蛋白的主要构成之一,我们想探究不同糖浓度培养液对层粘连蛋白α1(Laminin alpha 1LAMA1)的表达以及对细胞生长、粘附、迁移、增殖等常见生物学行为的影响,证明LAMA1是否在糖尿病性视网膜病病变的发生发展中起到一定作用。  方法:  1、预先配置好4种不同糖浓度细胞培养液(5mM、15mM、25mM、35mM),其中5mM组作为对照组(正常糖浓度组),使用不同糖浓度培养液常规培育ARPE-19 和 RF/6A 两种细胞,显微镜下观察相同位置、不同时间(0d、1d、2d、3d、4d)各组糖浓度下的细胞生长情况,并做拍照记录加以比较。  2、利用 Western Blot、qRT-PCR、IF免疫荧光技术检测在不同糖浓度下和时间梯度下(处理24h、48h后)的LAMA1的表达情况(包括蛋白水平、核酸水平、细胞水平)。  3、通过细胞划痕实验、CCK-8实验、细胞粘附实验分别检测两种细胞的迁移能力、增殖能力、粘附能力的变化,从而反映高糖对细胞生物学行为产生的影响。  结果:  本次研究我们发现,随着糖浓度增加,高糖组两种细胞的生长速度都较对照组(正常糖浓度5mM)加快,在处理相同时间情况下是糖浓度越高细胞生长越快。同样的,高糖组细胞的增殖、迁移、粘附能力都较正常组有不同程度提高:在细胞增殖能力方面,三个高糖组都较正常组提高,且之间差异具有统计学意义(P<0.05);在细胞水平迁移方面,处理24h后,高糖组有较正常组提高,但无统计学意义(P>0.05),随时间延长,25mM 和 35mM 组较对照组之间有明显差异,且差异具有统计学意义;在细胞粘附水平上,高糖组稍有提高,但无明显统计学差异,仅在处理8h后个别高糖组较低糖组间差异有意义。但非常有趣的是,随着糖浓度增加,两种细胞LAMA1蛋白的表达是先轻微升高,然后开始出现明显下降趋势,在ARPE-19组尤甚,细胞免疫荧光上差异不是太明显,但蛋白和核酸水平变化是有差异的且有统计学意义(P<0.05)。  结论:  高糖环境不同程度的增加了ARPE-19和RF/6A细胞的增殖、迁移、粘附能力,但降低LAMA1蛋白的表达。这些细胞生物学行为的改变,为糖尿病性视网膜病变的发生发展提供了可能,所以上述结果表明LAMA1可能在糖尿病视网膜病变发生发展中起到了一定作用。因此LAMA1未来或许可作为糖尿病视网膜病变的诊断或治疗的一个潜在靶点。
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