目的：　　食管癌是世界范围内常见的消化道肿瘤之一，患者早期无明显症状或症状十分轻微，待出现进行性吞咽困难后就诊，常常已发展到中晚期，失去了手术治疗的最好时机，目前联合化疗是晚期食管癌患者的首选治疗方案。顺铂是临床上应用最广泛的化疗药物之一，但是，许多患者在顺铂治疗过程中出现了化疗抵抗，影响治疗效果。　　DNA聚合酶β(DNA polymeraseβ，polβ)属于DNA聚合酶中的一员，是碱基切除修复(base excision repair，BER)中的关键酶，可填补DNA碱基损伤切除产生的单核苷酸缺口，对于基因组稳定性的维持至关重要。polβ的异常高表达和突变体可引起BER异常、自发突变率增加、基因组不稳定和染色体畸变等，在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。　　microRNAs（miRNAs）是一类长约18-25个核苷酸的内源性单链非编码RNA，在许多生物体内均有表达，并且高度保守。不同的miRNA在同一细胞中的调控作用不同，靶标分子可能不同，并且同一miRNA在不同细胞中的靶标分子也可能不同，调控作用也不尽相同。由于miRNAs可调控包括肿瘤相关基因在内的大量基因，因此miRNA的异常表达与肿瘤的发生发展及治疗预后有着密切关系。　　本课题组前期通过生物信息学软件分析发现，polβ可能是miR-499的靶基因。前期基因芯片分析结果显示，食管癌患者癌组织中miR-499的表达水平显著低于癌旁组织，并且化疗不敏感食管癌患者癌组织中miR-499的表达水平显著低于化疗敏感组织。通过对实验室保存的具有完整随访记录、组织中polβ已进行过测序的538例食管癌患者资料进行分析，发现177-234nt缺失型polβ的食管癌患者化疗抵抗，生存期较短。本研究旨在探索miR-499对食管癌细胞化疗敏感性的影响及其作用机制;明晰177-234nt缺失型polβ对食管癌细胞化疗敏感性作用及其机制。本研究共分为以下两部分。　　第一部分 miR-499靶向调控polβ对食管癌细胞化疗敏感性的影响　　方法：　　1.采用qRT-PCR和Western blot方法检测538例食管癌患者癌组织及其癌旁组织中的polβ和miR-499表达水平;分析食管癌患者癌组织中polβ表达量与miR-499表达量的相关性。　　2.建立稳定表达miR-499的EC9706和KYSE30细胞株，采用MTT、克隆形成实验、流式细胞术、免疫荧光和彗星实验方法检测miR-499对食管癌细胞EC9706的KYSE30化疗敏感性的影响。　　3.建立稳定表达miR-499的EC9706-Luc细胞株，接种到裸鼠右侧腋下。在裸鼠腹腔内按照每千克裸鼠体重3mg顺铂注射顺铂生理盐水溶液，三天一次，共9次。接种后每7天进行1次裸鼠移植瘤活体成像，观察移植瘤的生长情况。　　4.利用生物信息学软件分析miR-499的靶基因;构建polβ3UTR野生型和突变型报告载体，与miR-499mimic/negative control共转入食管癌细胞EC9706和KYSE30中，进行双荧光素酶报告实验验证polβ是否是miR-499的靶基因。　　5.构建无polβ3UTR的重组表达载体pcDNA3.1-polβ，转入稳定表达miR-499的EC9706和KYSE30细胞株，采用MTT和流式细胞术实验方法检测无3UTR的polβ对miR-499对食管癌细胞EC9706的KYSE30化疗敏感性影响的回复作用。　　结果:　　1.食管癌患者癌组织中miR-499的相对表达水平明显低于癌旁组织，差异有统计学意义(P＜0.05);食管癌患者癌组织中polβmRNA和蛋白的表达水平明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(P＜0.05);相关性分析结果显示，食管癌患者癌组织中miR-499与polβ表达量呈负相关。　　2.细胞学行为实验结果显示，与NC和Blank组相比，miR-499可增强顺铂对EC9706和KYSE30细胞的增殖抑制、凋亡促进作用，差异具有统计学意义（P＜0.05）。　　3.裸鼠移植瘤活体成像结果显示，miR-499组裸鼠移植瘤处的绝对光子数自第14天明显低于NC和Blank组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　4.生物信息学分析结果显示，polβ3UTR区包含可与miR-499互补结合的序列，polβ可能是miR-499的作用靶点。双荧光素酶报告实验结果显示，共转染miR-499mimic和polβ3UTR野生型重组载体的细胞中萤光素酶活性明显低于共转染miR-499mimic和polβ3UTR突变型重组载体，和转染miR-499negative control时的细胞(P＜0.05)。　　5.转染pcDNA3.1-polβ的miR-499组细胞的IC50较单独miR-499组明显升高（P＜0.05），凋亡细胞数百分比较单独miR-499组明显降低(P＜0.05)，无3UTR的polβ可回复miR-499对食管癌细胞EC9706和KYSE30化疗敏感性的影响。　　第二部分 177-234nt缺失型polβ对食管癌细胞化疗敏感性的影响　　方法:　　1.选择本实验室保存的有完整随访资料、组织中polβ已进行过测序的食管癌患者538例，用Kaplan-Meier方法进行食管癌患者的生存分析。　　2.建立稳定表达177-234nt缺失型polβ的EC9706细胞株，采用MTT和流式细胞术方法检测177-234nt缺失型polβ对食管癌细胞EC9706化疗敏感性的影响。　　3.将稳定表达177-234nt缺失型polβ和野生型polβ的EC9706细胞株接种到裸鼠右侧腋下。按照3mg/kg（顺铂/裸鼠体重）比例在裸鼠腹腔注射顺铂生理盐水溶液，三天一次。接种4周后处死裸鼠。剥离瘤体组织标本，拍照、称重。　　4.在链霉亲和素磁珠上偶联生物素标记的177-234nt缺失型polβ蛋白，与食管癌细胞裂解液孵育，分离结合蛋白后用质谱分析。　　5.采用BIAcore与pull-down实验验证PIK3IP1是否可与177-234nt缺失型polβ蛋白结合。　　6.采用Western blot方法检测稳定表达177-234nt缺失型polβ对EC9706细胞中PI3K-Akt通路蛋白表达水平的影响。　　7.采用MTT和流式细胞术方法比较Knock-down PIK3IP1与177-234nt缺失型polβ对EC9706细胞化疗敏感性的影响。　　8.在177-234nt缺失型polβ的EC9706细胞中加入PI3K抑制剂LY294002，采用MTT和流式细胞术方法检测PI3K抑制剂对177-234nt缺失型polβ影响EC9706化疗敏感性的回复作用。　　结果:　　1.Kaplan-Meier生存分析结果显示，177-234nt缺失型polβ患者生存期远差于野生型polβ的患者，差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　2.与野生型polβ细胞相比，177-234nt缺失型polβ可减弱顺铂/5-FU对EC9706细胞的增殖抑制、增加凋亡促进，差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　3.裸鼠移植瘤实验结果显示，177-234nt缺失型polβ组裸鼠移植瘤体重明显大于野生型裸鼠移植瘤体重（P＜0.05），差异具有统计学意义。　　4.根据质谱结果，分析EC9706细胞中PIK3IP1蛋白可能与177-234nt缺失型polβ蛋白结合。　　5.BIAcore与pull-down实验结果显示，PIK3IP1可与177-234nt缺失型polβ蛋白结合。　　6.Western blot结果显示，177-234nt缺失型polβ可促进Akt蛋白的磷酸化，从而抑制下游凋亡基因的活化、促进下游增殖基因的活化。　　7.与polβ-/-组相比，PIK3IP1siRNA和177-234nt缺失型polβ组细胞中顺铂/5-FU的增殖抑制能力和凋亡促进作用均减弱，差异具有统计学意义(P＜0.05)，而PIK3IP1siRNA和177-234nt缺失型polβ组间没有明显统计学差异(P＞0.05)。　　8.MTT和流式细胞术实验结果显示，PI3K抑制剂LY294002可通过抑制PI3K活化，增强顺铂/5-FU对EC9706细胞的增殖抑制和凋亡促进，部分回复177-234nt缺失型polβ对EC9706细胞化疗敏感性的作用。　　结论:　　1.miR-499通过靶向polβ3UTR调控polβ表达水平，增强顺铂对EC9706和KYSE30细胞的增殖抑制和凋亡促进作用，提高食管癌细胞的化疗敏感性。　　2.177-234nt缺失型polβ蛋白可通过结合PIK3IP1蛋白激活PI3K通路，减弱顺铂/5-FU对EC9706细胞的增殖抑制和凋亡促进作用，降低食管癌细胞的化疗敏感性。