大鼠去神经骨骼肌MyoD的表达

来源 :山西医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jbdh2009
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目的探讨MyoD在去神经骨骼肌萎缩早期不同部位、不同时段的表达情况。方法选择健康的雄性SD大鼠24只,体重195±5g,随机分成4组,即对照组(有神经支配)、实验A组(去神经2d)、实验B组(去神经7d)、实验C组(去神经28d),每组6只。大鼠分批用戊巴比妥钠(40mg/kg,ip)麻醉后,用右下肢后部中段切断坐骨神经的方法制作失神经骨骼肌动物模型,正常组仅做假手术(不切断坐骨神经),去神经组切断坐骨神经1cm以上,分别于去神经第2d、7d、28d处死大鼠(用脊椎脱臼法),用显微外科技术认真游离失神经骨骼肌(胫骨前肌、比目鱼肌、腓肠肌、跖肌),切取的肌肉样本快速置于-70℃冰箱冻存,备用。用RT-PCR法检测MyoD的mRNA:以GAPDH作为内参照,做半定量检测。取样本组织50mg匀浆后用上海生工抽提试剂进行总RNA抽提,然后用MBI的RT-PCR试剂盒,按样本RNA2μg,20μl体系进行反转录。MyoD的引物通过primer5.0引物设计软件设计,为MyoD mRNA序列的175-316,片断长度为151bp;作为内参照的GAPDH的引物由山西医科大学实验中心提供,片断长度为308bp。聚合酶链反应按50μl体系,反应条件为:94℃,2′,1cycle。94℃,30″;Tm(MyoD 53℃)/(GAPDH50℃),30″;72℃,2′,36 cycle。用琼脂糖凝胶水平电泳,电压采用160v。然后用凝胶成像仪获取图像。用免疫印迹法(Westernblot法)测定MyoD的蛋白质:用β-actin作为内参照,做半定量检测。取样本组织100mg匀浆后用普利莱蛋白提取试剂盒进行总蛋白抽提,煮沸、离心后,加样于垂直电泳槽行SDS-PAGE,电泳约3h,转膜1小时30分钟,封闭室温4小时,孵育一抗(Ab1)4℃过夜,漂洗后孵育二抗(Ab2)4℃约4小时,TBS漂洗后,置于暗室加ECL发光试剂盒反应,一分钟左右立即放在暗箱曝光,60秒左右取出浸入显影剂内,观察至最佳显影后,捞出在清水中洗净,然后置于定影剂中15分钟,取出晾干后用数码相机获取图片。最后用NIH的ImageJ软件获取数据,用SPSS软件进行统计分析。结果去神经骨骼肌萎缩时,不同肌肉(胫骨前肌、比目鱼肌、腓肠肌、跖肌)MyoD的mRNA和蛋白质在去神经支配后第2d、7d、28d不同时段表达均为上调,且与正常组进行方差分析组问比较(Tukey HSD),P<0.01,去神经组比正常组高2倍左右,差异显著。在每一时段,这四块肌肉MyoD的mRNA和蛋白质的表达用方差分析组间比较(Turkey法)进行统计分析,部分有统计差异,P<0.05。结论在SD大鼠失神经骨骼肌萎缩早期,MyoD的表达在快肌(胫骨前肌、腓肠肌、跖肌)和慢肌(比目鱼肌)均为上调;不同肌肉的MyoD的表达在不同时段仅部分有统计学差异。在骨骼肌萎缩过程中,MyoD有可能在细胞分子通路水平参与基因的调控,对延缓肌萎缩的进程可能发挥一定的积极作用,其具体机制有待进一步深入研究。
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