论文部分内容阅读
化石燃料储量的迅速减少、全球变暖等来自能源与环境的压力引发了世界范围内对可持续、可再生能源的追求。乙醇是一种安全、清洁的能源物质，利用可再生木质纤维素资源生物转化制取乙醇的研究成为当前的热点，而木质纤维水解后产生的戊糖如木糖的利用成为了该途径工业化的制约因素。因此，寻找能够高效利用木糖的菌株为本研究的重点。 酿酒酵母是一种非常安全的微生物菌种，在工业乙醇发酵过程中起到了非常重要的作用，野生的酿酒酵母不能天然利用木糖，因此需要引入木糖代谢关键基因。本试验所用到的初始菌株是此前已经进行分子改造且定向进化后的菌株E7，能够利用木糖。为了达到在原有基础上提高木糖的利用速率以及乙醇的产生速率及产量的目的，本课题主要对酵母菌进行了以下的改造并得到了一些较好的结果: (1)选择木糖还原酶XR、木糖醇脱氢酶XDH、木酮糖激酶XK、转醛酶TAL1、丙酮酸激酶PYK1这些木糖代谢限速酶以及木糖转运子mgt05195所对应的基因作为被调控对象，然后选择了4个常用组成型启动以及4个HSP（热激蛋白）启动予以及4个TCA（三羧酸）循环启动子与六个关键基因作了一些组合，利用golden gateassembly的方法连接起来，并采用共转化的方法转入到酵母中，最终得到了17株菌株。首先对17株菌进行初步的筛选，在80g/L葡萄糖与40g/L木糖以及3g/L乙酸的混合糖发酵培养基中发酵，用高效液相色谱检测样品中不同组分含量，选出目标菌株1Z、6YH、12YH与初始菌株E7进行整个发酵过程的对比，其中发酵效果最好的1Z在36h、48h时木糖消耗量分别为33.2g/L、36.1g/L，乙醇产量分别为53.5g/L、55.1g/L，分别达到了理论产量的93.2％与93.6％。 (2)将含有外源乳酸克鲁维酵母丙酮酸激酶基因的2z-e7表达簇转入到E7中得到2Z，2Z在36h、48h的木糖消耗量分别为33.8g/L、36.9g/L，乙醇产量为52.1g/L、52.8g/L，分别达到了理论产量的91.8％与90.6％，相较于1Z发酵性能并没有提升，说明外源性丙酮酸激酶基因klPYK1并没有发挥出其在体外实验中的优势，没有得到预期的结果。 (3)然后，将1z-e7表达簇转入到1Z中，得到1Z1Z菌株，1Z1Z在36h、48h的木糖消耗量分别为33.2g/L、36.3g/L，乙醇产量分别为53.4g/L、55.3g/L，分别达到了理论产量的93.7％与94.5％，发酵性能相较1Z有一定提高。说明木糖代谢途径关键基因拷贝数的增加有利于加快发酵进程。 (4)此外，E7是E5菌株定向进化得来，E7在36h、48h分别比E5多消耗了13.5g/L、13.2g/L的木糖，多产出了11.3g/L、10.6g/L的乙醇。在48h时E5的乙醇产量达到了理论产量的81.1％，E7的为91.5％，E7比E5的提高了10.4％。说明定向进化与分子改造相结合可以大大加快菌株木糖的代谢速率以及乙醇的产生速度 (5)对定向进化后的二倍体A2进行基因改造，转入1z-e7、2z-e7表达簇，得到A21Z、A22Z，两菌株都在原有基础上将提高了乙醇产量以及加快木糖的利用速率，其中发酵效果较好的A21Z最终木糖消耗量为37.5g/L，乙醇产量为53.5g/L，达到了理论产量的90.7％。说明1z-e7是一个有效、稳定的木糖代谢途径的表达簇。 综上，从E5到1Z1Z，其发酵成果取得了阶段性的进展，为生物乙醇的应用基础研究提供新的实验证据和理论基础，并为菌株工业化打下了良好的基础。