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布鲁氏菌病是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种人畜共患传染病，感染的患者主要表现出波状热、乏力、肌肉/关节疼痛、肝脾肿大、生殖系统发育不全和严重的炎症反应等。该病流行使我国每年在畜牧业上的经济损失可达10亿，并且给食品安全带来很大的隐患，对健康构成严重的威胁。因此，对布鲁氏病的发病机制研究，寻找有效的治疗性药物和疫苗迫在眉睫。布鲁氏菌是革兰氏阴性兼性胞内致病菌，目前研究发现主要的毒力因子有脂多糖（LPS）、BvrR/BvrS双组分系统、virB(IV型分泌系统)、应激反应蛋白、密度感应(Quorum sensing，QS)系统、外膜蛋白等。当前已证明在布鲁氏菌培养液中，外膜蛋白OMP25能直接与巨噬细胞膜作用，抑制肿瘤坏死因子的产生，同时它不会影响IL-8、IL-1β、IL-6等细胞因子的产生。本研究寻找与外膜蛋白OMP25结合巨噬细胞膜上的受体及作用位点，为进一步认识OMP25在布鲁氏菌逃避巨噬细胞杀伤作用机制和对肿瘤坏死因子抑制的信号通路方面的调节作用奠定基础。 利用本实验室已经构建好的pET32a-omp25表达载体，在IPTG诱导下表达重组OMP25蛋白，运用Ni柱纯化OMP25；采用噬菌体展示技术，以OMP25蛋白为抗原从M13噬菌体环形多肽展示库中进行环形7肽（c7c）的筛选，通过DNAMAN、Clustalx、NCBI等生物信息学软件分析筛选出潜在的有效多肽，推测OMP25在小鼠巨噬细胞RAW264.7膜上可能的受体；设置实验组和对照组，用牛种布鲁氏菌2308和疫苗株RB51侵染小鼠巨噬细胞，在不同的时间点检测多肽对布鲁氏菌侵染巨噬细胞的影响和巨噬细胞产生肿瘤坏死因子(TNF-α)的影响；对生物信息学推测的受体基因构建RNA干扰载体，应用siDESIGN Center网页对受体设计9个阳性干扰片段和1个阴性干扰片段，在pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体上选择EcoRI和BamHI两个酶切位点，将干扰片段连入载体，然后转入大肠杆菌DH5α，测序检测，为受体在布鲁氏菌侵染过程中的功能验证做好上游工作。 实验结果：1.SDS-PAGE证明重组OMP25蛋白获得了纯化；2.从M13噬菌体库中筛选出了5种环形7肽，分别是：GH-6、ST-7、MT-7、TF-7、SN-7；通过生物信息学软件分析推测出小鼠巨噬细胞上的载脂蛋白（ApoBR）；3.布鲁氏菌侵染巨噬细胞CFU初步说明噬菌体展示技术筛选的5个多肽中GH-6、TF-7、SN-7对2308侵染小鼠巨噬细胞既抑制入侵又抑制胞内生存，ST-7、MT-7对其只起抑制入侵的作用；ST-7对RB51侵染小鼠巨噬细胞只起抑制入侵作用，MT-7、TF-7、SN-7对其只起抑制胞内生存作用；4.通过测序检测成功构建六个干扰载体ApoBR-253、ApoBR-893、ApoBR-2053、ApoBR-1138、ApoBR-1325和CK。 本实验结果说明布鲁氏菌外膜蛋白OMP25在布鲁氏菌侵染巨噬细胞时起到重要的作用，ST-7可能是巨噬细胞上与OMP25结合的主要位点之一。其他多肽在布鲁氏菌侵染巨噬细胞中能有效地调节入侵和胞内生存。说明布鲁氏菌入侵和胞内生存是一个多因子调节过程，同时也证明了这5个多肽不但能分别抑制布鲁氏菌入侵还能抑制布鲁氏菌在胞内的抗清除。为人为激活天然免疫提供了一个靶位点和抑制胞内生存提供了潜在的调节位点，为寻找对布鲁氏菌病有效的治疗性药物提供科学依据。