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目的:阿尔茨海默病以进行性认知功能障碍和行为损害为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病,是痴呆中最常见的类型,随着人口老龄化而进一步增加,现有的治疗措施只能适度改善症状而无法治愈。阿尔茨海默病不仅会给患者和护理人员带来严重的痛苦,而且给社会带来了巨大的经济负担。阿尔茨海默病的发病机制复杂,主要涉及β-淀粉样蛋白异常代谢,tau蛋白过度磷酸化,氧化应激,血脑屏障破坏等。血脑屏障能够限制神经毒性物质、炎症因子等从外周进入中枢神经系统,维持大脑微环境稳态。血脑屏障由脑微血管内皮细胞,周细胞,细胞外基质和血管周围星形胶质细胞的足突构成,相邻脑微血管内皮细胞之间的紧密连接是维持血脑屏障完整性的重要结构和功能基础。Occludin和claudins是定位于脑微血管内皮细胞紧密连接间的完整的膜蛋白,ZO蛋白将紧密连接的整合膜蛋白与细胞骨架链接。因此靶向调节血脑屏障的通透性可能成为治疗阿尔茨海默病的有效手段。美金刚是一种低亲和力的,非竞争性的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂。研究发现,MEM在蛛网膜下腔出血后立即应用可减少神经元和内皮细胞的损伤,但对阿尔茨海默病的血脑屏障通透性的调节作用与机制尚未见报道。长链非编码RNA可在转录及转录后水平参与生物学过程的调控,近年来,其在中枢神经系统中的作用受到研究者们的重视。研究发现SNHG1在帕金森病的早期的表达就已经失调,SNHG1的表达失调促进了帕金森神经炎症的发生。SCAMP1在脑组织中表达广泛,且可与突触形成相关。目前LINC00094,SNHG1和SCAMP1在阿尔茨海默病中的作用尚无报道。RNA结合蛋白可以在转录后水平的调控中发挥着重要作用,其作用包括RNA剪接、RNA转运及影响mRNA的稳定性等。研究证实,RNA结合蛋白可以结合非编码RNA并进一步影响非编码RNA的生物学功能。研究发现MOV10在宫颈癌等肿瘤细胞中高表达,但尚未见其在阿尔茨海默病中的相关报道。MiRNAs可参与多种细胞进程,如细胞增殖,分化,凋亡,应激反应和代谢等,它们在神经退行性疾病中的作用已被广泛报道。目前miR-224-5p,miR-497-5p对阿尔茨海默病血脑屏障通透性的调节作用尚未见报道。本研究首先研究LINC00094,MOV10和SNHG1/SCAMP1在Abeta孵育的人脑微血管内皮细胞中的表达及功能,进一步探讨上述因子间可能的调控关系及对阿尔茨海默病血脑屏障通透性的调节作用,旨在从血脑屏障的角度为阿尔茨海默病的治疗提供新的策略。研究方法:1、构建体外的BBB模型;2、qRT-PCR方法检测LINC00094、miR-224-5p、miR-497-5p、Endophilin-1、MOV10、SNHG1、SCAMP1、FOSL2和NFE2的表达情况;3、Western blot检测Endophilin-1、ZO-1、occludin、claudin-5、MOV10、FOSL2和NFE2地表达水平;4、在AD-ECs中稳定转染LINC00094沉默的质粒、Endophilin-1过表达的质粒、MOV10沉默地质粒、SNHG1沉默地质粒、SCAMP1沉默的质粒、FOSL2过表达的质粒、FOSL2沉默质粒、NFE2过表达质粒、NFE2沉默质粒、瞬时转染agomir-224-5p、agomir-497-5p、antagomir-224-5p、antagomir-497-5p;5、TEER实验检测BBB完整性;6、HRP渗出量实验检测BBB通透性;7、免疫荧光实验检测紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达水平和分布情况;8、双荧光素酶报告基因实验验证LINC00094与miR-224-5p/miR-497-5p、miR-224-5p/miR-497-5p与Endophilin-1的结合作用及结合位点;9、RNA结合蛋白免疫共沉淀实验LINC00094、miR-224-5p/miR-497-5p与Ago2的结合作用,MOV10与SNHG1/SCMAP1的结合作用,SNHG1/SCAMP1与EZH2的结合作用;10、染色质免疫共沉淀实验验证FOSL2/NFE2与ZnT1、ZnT3和MOV10启动子区的结合作用。结果:1、LINC00094在AD-ECs中高表达,在MEM-ECs中低表达,沉默LINC00094的表达显著增加了TEER值、降低HRP渗出量;同时促进ZO-1、occludin和claudin-5的表达,并使细胞膜上的分布由相对连续状态变为不连续状态。2、MEM与沉默LINC00094联合应用使得降低BBB通透性的作用最明显。3、LINC00094与miR-224-5p、miR-497-5p靶向结合,并共同富集于Ago2复合体中。4、在LINC00094表达沉默的AD-ECs中同时过表达miR-224-5p/miR-497-5p,显著增加了沉默LINC00094对TEER值的促进、对HRP的抑制作用;同时显著增加了沉默LINC00094对ZO-1、occludin和claudin-5的表达的促进作用。与此相反,在LINC00094表达沉默的AD-ECs中沉默miR-224-5p/miR-497-5p,逆转了上述效应。5、miR-224-5p/miR-497-5p在AD-ECs中低表达,在MEM-ECs中高表达;过表达的miR-224-5p/miR-497-5p显著增加了TEER值、降低HRP渗出量;同时显著促进了ZO-1、occludin和claudin-5的表达,并使细胞膜上ZO-1、occludin和claudin-5的分布由相对的不连续状态变为连续状态。6、miR-224-5p/miR-497-5p靶向结合Endophilin-1。与此同时,在AD-ECs中过表达miR-224-5p/miR-497-5p显著抑制了Endophilin-1的表达。7、在AD-ECs中双过表达Endophilin-1和miR-224-5p/miR-497-5p,显著逆转了单独过表达miR-224-5p/miR-497-5p对TEER值的增加及对HRP降低的作用,同时显著逆转了miR-224-5p/miR-497-5p对ZO-1、occludin和claudin-5表达的促进作用。8、MOV10在AD-ECs中高表达,敲减MOV10显著降低了BBB通透性。9、SNHG1和SCAMP1在AD-ECs中低表达,敲减SNHG1和SCAMP1显著增加了BBB通透性。10、敲减MOV10上调了AD-ECs中SNHG1和SCAMP1的表达并增加了它们的稳定性。11、FOSL2和NFE2在AD-ECs中高表达,沉默FOSL2和NFE2降低了BBB的通透性。12、SNHG1和SCAMP1通过PRC2复合体途径抑制FOSL2和NFE2的表达。13、FOSL2/NFE2可以结合ZnT1、ZnT3和MOV10的启动子区并促进其表达,进一步形成反馈环路影响AD微环境下BBB的通透性。结论:1.MEM联合敲减LINC00094降低BBB通透性。2.LINC00094通过靶向结合miR-224-5p、miR-497-5p减弱对其Endophilin-1的转录后抑制进而调节BBB通透性。3.MEM通过LINC00094/miR-224-5p(miR-497-5p)/Endophilin-1途径调控AD微环境下BBB通透性。4.MOV10、FOSL2和NFE2在AD-ECs中高表达,分别沉默MOV10、FOSL2和NFE2均能降低AD微环境下BBB的通透性。SNHG1和SCAMP1在AD-ECs中低表达,沉默SNHG1、SCAMP1均能增加AD微环境下BBB的通透性。5.MOV10通过降低SNHG1/SCAMP1稳定性降低AD微环境下的BBB通透性,SNHG1/SCAMP1通过PRC2复合体途径调控FOSL2/NFE2的表达进而影响AD微环境下的BBB通透性。6.MOV10结合SNHG1/SCAMP1形成反馈环路调控AD微环境下BBB的通透性。