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研究背景和目的胃癌(Gastric Cancer,GC)是现在全球最为常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在我国的恶性肿瘤中高居第二位。尽管近年来在胃癌的诊断和治疗上取得一定进步,但胃癌术后复发率较高,总体预后仍不乐观。因此,迫切需要我们进一步探索胃癌发生、发展的相关机制,发现新型的胃癌生物标志物,从而找到新的胃癌诊治的关键突破点,提高目前胃癌早期诊断和治疗的水平。EphB6是Eph/ephrin家族的成员之一,属于酪氨酸激酶受体中的一种激酶缺陷型受体。大量研究提示EphB6表达的下调或缺失与多种恶性肿瘤的发生发展及预后密切相关。其在肿瘤中可能发挥着抑癌基因的作用,但这仍存在一定争议。相对于胃癌而言,EphB6的表达和意义目前尚未取得很好的研究。本课题前期通过对胃癌患者外周血样本ctDNA高通量测序,发现多例EphB6基因高频突变。基于国内外研究进展和前期研究结果,我们以胃癌为研究对象,将EphB6作为目的基因,明确EphB6在胃癌组织和胃癌细胞系中的表达,构建EphB6稳定过表达的胃癌细胞系,观察其对胃癌细胞特征性生物学行为的影响,并初步探索相关分子机制。研究方法1.应用Western blot技术检测正常胃上皮细胞GES-1和4种胃癌细胞系(MGC-803、MKN-45、AGS、SGC-7901)中EphB6蛋白的表达情况,运用免疫细胞化学染色方法观察EphB6蛋白在细胞中的定位分布情况,采用免疫组化技术检测胃癌组织及对应的癌旁正常组织中EphB6蛋白的表达情况,并进一步分析EphB6蛋白表达水平与患者临床病理参数的关系;2.构建人EphB6基因慢病毒过表达载体并进行病毒包装与鉴定,将慢病毒体外转染EphB6相对低表达的人胃癌细胞株,利用Puromycin筛选、Western blot方法验证获得稳定过表达EphB6蛋白的稳转细胞株;3.通过CCK-8法、Transwell侵袭实验及流式细胞仪PI单染法及Annexin V染色法分别考察细胞EphB6过表达前后增殖、侵袭转移、细胞周期分布及凋亡等生物学特性的变化;4.应用qRT-PCR检测EphB6对其配体EFNB2的影响。研究结果1.EphB6蛋白在所检测的细胞系中均存在不同程度表达,其在MGC-803、AGS和SGC-7901细胞中的表达显著低于GES-1细胞(P<0.01),AGS细胞的表达量相对最低;EphB6蛋白阳性染色在细胞质内呈橘黄色粗颗粒样弥散分布,表达最强处位于组织腺体隐窝基底部干细胞;EphB6蛋白在胃癌癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织(P<0.001),其表达的下调与胃癌临床病理参数的相关性分析表明:EphB6蛋白表达水平与患者性别、年龄、肿瘤部位、浸润深度、有无神经侵犯和淋巴结转移无显著相关,但与肿瘤分化程度呈明显正相关(P=0.03<0.05),与有无脉管癌栓(P=0.018<0.05)及肿瘤临床分期(P=0.016<0.05)呈明显负相关。2.重组质粒构建成功,测序结果和预期一致,经慢病毒包装成功获得EphB6慢病毒重组过表达载体,且病毒滴度满足后续实验要求;AGS和SGC-7901细胞感染过表达慢病毒后其EphB6蛋白水平明显升高(P<0.01)。3.CCK-8法检测增殖结果显示:随着实验的进程(48h、72h、96h),无论AGS还是SGC-7901细胞,EphB6过表达实验组OD值较空载体对照组显著下降(P<0.05),将数据转化为增殖率后同样显示:随着实验的进程,对照组细胞增长的倍数明显大于实验组(P<0.05);流式细胞仪检测细胞周期分布显示:AGS和SGC-7901实验组较对照组G1期细胞比例显著增加(P<0.001),S期细胞比例显著减少(P<0.01);流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示:AGS和SGC-7901实验组较对照组细胞凋亡指数均未见统计学差异;Transwell实验检测侵袭转移能力结果显示:AGS和SGC-7901实验组的转移细胞数较其对照组均显著减少(P<0.001)。4.实验组中EFNB2 mRNA的表达水平较对照组显著增加(P<0.001)。结论1.EphB6蛋白在胃癌细胞系和胃癌组织中表达水平均显著下调,且其在胃癌组织中表达下调与脉管癌栓、肿瘤分化和临床分期密切相关,提示EphB6可能具有抑制胃癌增殖和转移的作用,参与了胃癌的早期发生形成和肿瘤的进展,EphB6蛋白表达水平有可能作为判断胃癌进展程度及预后的参考指标。2.成功构建EphB6慢病毒重组过表达载体以及EphB6蛋白稳定过表达的AGS和SGC-7901胃癌细胞株,为后续研究奠定了基础。3.过表达EphB6能够显著抑制AGS和SGC-7901胃癌细胞的增殖和侵袭能力,而对细胞的凋亡无明显影响,并发现其对细胞增殖的抑制可能是通过阻滞细胞G1期向S期转变来实现的,进一步证实了EphB6具有抑制胃癌的增殖生长、侵袭转移的功能。4.EphB6过表达能够上调其配体EFNB2的表达,并可能将其作为一种肿瘤自身的保护机制。在脱离这种保护机制的情况下,EphB6的抑癌功能可能会更加强大。