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目的：原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率在世界范围内居恶性肿瘤的第五位，死亡率居第三位，而在我国年发病率居第三位，年患病率约为10～150/10万人，死于原发性肝癌的患者约32万人/年。根据回顾性调查结果表明原发性肝癌的发病率有逐年增加的趋势，HBV感染引起的慢性乙型肝炎是原发性肝癌最重要的病因之一。针对原发性肝癌进展迅猛、高侵袭性，血管密度高等特性，临床上已有针对血液供应的治疗策略，如血管栓塞、抗VEGFR生物治疗等，但预后并不理想。针对肿瘤细胞增殖迅速相对低氧的微环境，课题组前期研究证明低氧诱导HIF-1α的表达可上调HSP70-2表达从而抵抗凋亡，HepG2与HBV稳定复制的HepG2.215细胞间热休克蛋白70-2的表达存在差异，其机制尚不清楚。鉴于此，本课题探讨了低氧微环境下，肝癌细胞HepG2及HBV稳定复制的HepG2.215的增殖、凋亡及凋亡相关基因survivin、转录因子HIF-1?及VEGF的表达变化及机制，为以其为靶点的干预研究奠定基础。 方法：①细胞增殖试验：采用CCK-8试剂盒检测低氧条件下，L02/HepG2/HepG2.215细胞在不同时间点（0h、24h、48h、72h）OD值，以及通过细胞染色等方法检测细胞的增殖；②细胞凋亡检测：采用AnnexinV-FITC和PI双染色FCM检测L02/HepG2/HepG2.215细胞在1％低氧条件下，0h/3h/6h/12h/24h/48h/72h的凋亡与坏死；③免疫印迹：采用WesternBlot检测1%低氧条件下，不同时间点（0h/3h/6h/12h/24h/48h/72h）L02/HepG2/HepG2.215细胞内HIF-1?/VEGF/Survivin的表达；④miRNA基因芯片及microRNA检测：用trizol法提取HepG2细胞和HepG2.215细胞的总RNA，用miRNA基因芯片检测两种细胞中miRNA的表达差异。对有表达差异的miRNA采用生物信息学方法分析针对HIF-1?的miRNA表达的差异；⑤细胞趋化实验：1×104L02/HepG2/HepG2.215细胞放置于transwell小室中的下室，1×103THP-1细胞置于上室，低氧条件下培养48h，常规固定及结晶紫染色检测通过PMA诱导的THP-1分化为巨噬细胞的趋化；⑥Arg1、Fizz1、iNOS的表达的检测：1×105L02/HepG2/HepG2.215细胞1%低氧培养48h后，取上清与1×104THP-1细胞共培养48h，RT-PCR检测PMA诱导THP-1分化为巨噬细胞后Arg1、Fizz1、iNOS的表达。 结果：⑴细胞增殖实验结果表明，低氧条件下培养72hL02/HepG2/HepG2.215的增殖率均分别高于普通组，提示低氧微环境有利于L02/HepG2/HepG2.215细胞的增殖。⑵AnnexinV/PI双染色FCM检测细胞凋亡结果表明，在1%低氧条件下培养72h，L02/HepG2/HepG2.215细胞凋亡率低于普通培养组，但无统计学差异,结果提示低氧并不促进细胞凋亡。⑶WB结果显示，HepG2细胞及HepG2.215细胞内HIF-1?表达在低氧6h后达到高峰，并维持在高于正常水平；LO2细胞HIF-1表达在低氧48h后达到高峰，维持在高于正常水平；在各时间点中，HepG2.215细胞内HIF-1?表达均显著高于HepG2细胞，结果提示低氧可诱导肝癌细胞高表达HIF-1，且HBV稳定表达的细胞其表达增高更为显著；3种细胞survivin蛋白的表达在低氧12h均达到高峰，48h有下降趋势，但仍高于对照组。⑷miRNA基因芯片检测，通过生物信息学分析，与HepG2细胞相比，发现HepG2.215细胞靶向HIF-1的miRNA（miR-2392，miR-3945，miR-1914-3p，miR-1236-5p和miR-4253）表达下调。⑸与普通培养相比，1%低氧环境下，肝癌细胞HepG2/HepG2.215培养上清对PMA诱导的THP-1细胞分化为巨噬细胞的趋化能力减弱，但促进PMA诱导THP-1细胞分化的巨噬细胞向M2极化，抑制其向M1极化。 结论：①低氧环境培养下L02/HepG2/HepG2.215细胞凋亡率相对降低，而细胞增殖率显著增高，并诱导HIF-1α和survivin高表达，提示其对于肝癌细胞耐受低氧并促进其增殖发挥着重要作用；②低氧环境培养下HBV稳定表达的HepG2.215细胞HIF-1α上调更为显著，并维持较高水平，可能与HBV稳定表达的肝癌细胞靶向HIF-1α的miRNA下调有关，详细机制有待于进一步深入研究；③低氧诱导的肝癌细胞培养上清虽然趋化PMA诱导THP-1分化为巨噬细胞的能力减弱，但可以促进PMA诱导THP-1分化为巨噬细胞向M2极化，结果提示低氧可能有利于肝癌免疫耐受微环境的形成。