咖啡碱是茶叶的有效成份之一，具有兴奋中枢神经、强心活血、抗衰老等药理作用，但容易引起心悸、失眠、焦虑等不良反应，尤其不适合神经衰弱者、心血管疾病患者和孕妇等特殊人群饮用。随着国内外茶叶消费市场对无咖啡碱茶叶的需求迅速增长，培育低咖啡碱的茶树品种势在必行。N．甲基转移酶(N-methyltransferase，NMT)是茶树、咖啡、可可等植物中咖啡碱合成的关键酶类，克隆NMT基因并研究其表达特性是开展低咖啡碱茶叶特殊代谢机理研究的基础。本研究以低咖啡碱、高可可碱的特殊资源——南昆山毛叶茶为主要研究材料，以山茶属植物不同生物碱模式的——英红9号、福云6号、油茶、红山茶为对照，克隆研究了南昆山毛叶茶等山茶属植物的NMT基因，并研究了其时空表达特性，为进一步开展相关研究奠定了基础。本研究结果如下： 1．山茶属植物的生物碱含量 本研究按IS010727法测定山茶属植物的咖啡碱、可可碱和茶碱含量。结果表明，南昆山毛叶茶的咖啡碱和可可碱含量分别占干物质的0．38％和3．72％，属于低咖啡碱、高可可碱山茶植物模式；英g19号的咖啡碱和可可碱含量分别为4．01％、0．76％，福云6号的咖啡碱和可可碱含量分别为3．06％、0．54％，两者属于高咖啡碱、低可可碱山茶植物模式；油茶咖啡碱和可可碱含量分别为0．56％、0．29％，红山茶的咖啡碱含量为0．36％，而可可碱含量低于检测水平，两者属于低咖啡碱、低可可碱山茶植物模式。上述山茶属植物的生物碱含量随季节不同稍有波动，但所属的生物碱模式不改变。 2．山茶属植物NMT基因的克隆 本研究根据TCSt基因的5’非编码区和3’非编码区核苷酸序列设计引物，采用RT-PCR方法克隆得到南昆山毛叶茶、英红9号、福云6号的NMT基因，长度分别为1360bn，1357bp，1357bp。这3个NMT基因具有完整的开放阅读框，分别编码365，369，369个氨基酸，并具有SAM结合位点A、B’、C和保守域YFFF。序列分析表明，本研究克隆的3个NMT基因与NCBI数据库公布的山茶属植物NMT基因氨基酸序列的同源性高于86．3％。采用相同实验方法未能获得油茶和红山茶的NMT基因。 3．山茶属植物NMT基因的时空表达特性 本研究以福云6号的NMT基因为探针，提取不同‘山茶品种、不同季节、不同叶位的RNA，分别进行Northern杂交，发现NMT基因具有以下表达特性：从时间表达模式上看，南昆山毛叶茶、英红9号、福云6号的NMT基因在春、夏、秋三季都有表达。在同一季节里，这三个品种之间NMT基因的表达量无明显差异；而对不同季节，英红9号和福云6号在夏季的表达量比春季、秋季稍高。油茶、红山茶没有杂交信号。从空间表达模式上看F南昆山毛叶茶、英红9号、福云6号三个品种的芽尖、第一叶、第二叶、第三叶这4个叶位都有NMT基因表达，且各品种各季节都表现出芽尖的表达量比叶片高，符合茶叶咖啡碱等内含物质的趋嫩分布特性。