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三色堇(Viola tricolor)花色丰富、花期长且耐寒,为世界知名的花坛花卉。但三色堇忌酷热,较难适应我国夏季高温气候条件,导致夏季育苗难、观赏期缩短。发掘耐热基因对了解其热响应机制具有重要意义。热激蛋白(HSP)是热响应蛋白的重要组成部分,小分子热激蛋白(sHSP)是热激蛋白家族最重要的蛋白之一。本试验以三色堇耐热自交系DFM-16在42℃热激处理1 h、2 h的转录组数据为背景,为了研究热胁迫下不同材料在不同时间段的表达情况,对三色堇小分子热激蛋白基因家族进行定量及序列分析,为进一步了解三色堇小分子热激蛋白基因的结构及功能对其进行克隆及表达载体构建。研究结果如下:1.基于三色堇热胁迫转录组分析结果,筛选出15个sHSP基因。采用实时荧光定量PCR分别对15个sHSP基因在2份材料42℃处理1 h,2 h,6 h,12 h表达情况进行了分析。结果表明,15个sHSP基因均受热胁迫诱导,为三色堇热响应基因。耐热材料DFM-16在热激下的转录水平和对照相比表达最高峰主要集中在1 h和12 h,12 h仍然无明显回落趋势。热敏材料08H在热激下的转录水平和对照相比表达最高峰主要集中在6 h大多数基因在12 h有明显回落。因此DFM-16在热激下sHSP基因的转录更迅速大量累积需要时间短,且持续表达水平比在08H中更持久,因此我们可以推测DFM-16相对于08H更耐热,可能是受小分子热激蛋白转录水平的影响。同一个基因在不同品种中表达模式相同的只有VtHSP17-2和VtHSP22-1其余13个基因在不同三色堇材料中的表达模式均不相同,说明三色堇小分子热激蛋白家族基因在不同植物材料中的表达有很高的特异性,这与之前在其他物种上的研究一致。生物信息学分析表明,11个可以检索到完整的开放阅读框(ORF),属于亲水蛋白非分泌蛋白,具多个磷酸化位点。6个三色堇sHSP基因(VtHSP17.6、VtHSP17-1、VtHSP17-2、VtHSP17.8、VtHSP17.9-1、VtHSP17.9-2)属于细胞质家族,3个(VtHSP24、VtHSP26.3、VtHSP26.4-2)属于叶绿体家族,2个(VtHSP13、VtHSP26.4-1)属于线粒体家族。2.利用RACE技术,从耐热自交系DFM-16中克隆到了3个sHSP基因(VtHSP18、VtHSP13.2和VtHSP17.5),从热敏材料08H中克隆到1个sHSP基因(H-VtHSP17.6)。VtHSP17.5、H-VtHSP17.6为同源基因相似率为94.56%,没有在08H中克隆到VtHSP18和VtHSP13.2以及其同源序列,可能由于启动子的突变或者转录因子无法诱导,导致这两个基因在08H中没有表达或者表达量很低,因此我们推测VtHSP18和VtHSP13.2在热响应机制中有重要作用。4个蛋白均为亲水性非分泌蛋白蛋白,含有多个磷酸化位点。sHSP基因家族的系统发育分析结果显示三色堇VtHSP13.2属细胞质Ⅶ(CⅦ)亚类;VtHSP18属细胞质Ⅰ亚类(CⅠ);VtHSP17.5、H-VtHSP17.6叶绿体家族(CP)。根据功能进化树结果推测VtHSP18、VtHSP17.5、H-VtHSP17.6也具有响应高温胁迫的功能,可以提高植物的耐热性;VtHSP13.2具有多重诱导,除提高植物耐高温能力外,还可以提高植物耐低温及盐碱能力。3.利用pJIBIA163-1300载体,通过双酶切法构建VtHSP18超量表达载体,为进一步研究三色堇小热激蛋白VtHSP18证奠定了基础。