论文部分内容阅读
精原干细胞（Spermatogonial stem cells,SSCs）指既能自我更新维持自身群体数量恒定,又能定向分化成生殖细胞进而产生精子的一类原始精原细胞,具有干细胞最根本的生物学性质。目前,SSCs的研究在动物精子发生发育机理、医学临床的男性生殖生理和转基因动物的制备等方面具有广阔的应用前景,已成为干细胞研究的热点之一。本试验以小鼠精原干细胞为材料,对其冷冻保存、培养以及体内介导的转基因技术进行初步研究,以期为SSCs的进一步研究和利用提供参考资料。本试验的具体内容如下:1.用组合酶消化法制备6日龄小鼠的生殖细胞悬液;采用差速贴壁法结合Percoll不连续密度梯度离心法分离纯化精原干细胞,接种于含10%胎牛血清的极限必需培养基α（minimum essential medium alpha,MEMα）中,37℃,5%CO2饱和湿度培养,观察培养细胞的生长和形态变化。结果6日龄小鼠的生精小管主要包含细胞为精原干细胞、支持细胞,精原干细胞纯化后纯度达80%以上,精原干细胞主要分布在28%～36%的Percoll梯度中。2.以6日龄雄性昆明小白鼠精原干细胞为材料,加入不同的冷冻液以及采用不同的降温速率冷冻小鼠精原干细胞。以MEMα为基本培养基,加入10%胎牛血清和100ng/mL的胶质细胞源性神经营养因子,体外培养复苏后精原干细胞,WST-8比色法分析培养精原干细胞的增殖率,运用碱性磷酸酶细胞化学染色和逆转录.聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）技术,对培养的精原干细胞进行鉴定,采用睾丸网注射法将非程控降温方式冷冻的小鼠精原干细胞移植到受体不育小鼠睾丸生精小管,检测精原干细胞特性。结果显示,冷冻液中添加10%二甲基亚砜、10%胎牛血清、0.07mol/L蔗糖时,以1℃/min程控降温方式冷冻小鼠SSCs,细胞解冻后活率最高,达84%以上;采用非程控降温方式冻存精原干细胞,尽管细胞解冻后活率相对于程控降温方式略低,但具有方法简单、易于操作、无需昂贵仪器的优点,复苏后精原干细胞贴壁时间为8 h～12 h,24 h可见细胞分裂,48 h细胞出现迅速增殖,96 h可见较多含20～25细胞的细胞团,此时,精原干细胞增殖近5倍;精原干细胞移植后,在受体小鼠睾丸生精小管重新启动精子发生。试验结果表明,本试验所用的冷冻条件可以使经长期冷冻的精原干细胞保留其特性;所用培养条件可以使经长期冷冻的精原干细胞短期快速增殖。3.应用显微注射仪将脂质体包裹的质粒pEGFP-N1通过睾丸网注射到4周龄昆明小白鼠睾丸生精小管内。注射后6周,与自然发情雌鼠交配,分娩后3周,剪取仔鼠尾,提取基因组DNA,应用PcR法和斑点杂交法检测仔鼠基因组中的外源DNA整合。结果,共注射4只雄性小鼠,3只存活,并且具有交配能力,共获仔鼠63只,其中2只为PCR阳性和点杂交阳性仔鼠。试验结果初步证明,用睾丸网注射法制备转基因动物是可行的。