背景：鉴于糖尿病的高发病率，及其与心衰、慢性难愈性创面等疾病之间的关系，越来越多研究开始关注糖尿病与这些病理状态之间的内在联系。脂肪源性激素及细胞因子（脂肪因子）对心肌功能发挥重要的调节作用，大量的证据表明，大部分细胞因子（包括TNF-α、瘦素、TGF-β和抵抗素等）对心脏代谢、心肌细胞肥大、基质结构及其组成以及心肌细胞死亡起负性调节作用。虽然脂肪因子可促进细胞摄取糖，促进脂肪酸氧化，抵抗缺血/再灌注损伤，但是脂联素对慢性心肌重构及心衰发展的作用目前还是饱受争议。是否还存在其他的脂肪因子，对心肌缺血后心肌重构起到正性调节作用，改善心脏功能，目前尚未明确。是否某种脂肪因子可以促进伤口边缘血管化，从而加速伤口愈合目前受到人们的关注。近来，人们发现了一个高度保守的脂联素同源异构物家族，即C1q肿瘤坏死因子相关蛋白（CTRPs）家族。CTRPs家族包括15个成员，CTRP1-CTRP15，其中CTRP8和CTRP10是人特异性的，每个成员都是由四个结构域组成的，包括N端的信号肽、短的可变区、胶原样结构域和C端的C1q样球状结构域。CTRPs和脂联素均属于C1q/TNF蛋白超家族，由于越来越多的C1Q结构域蛋白被发现，C1q/TNF蛋白超家族成员不断增加。尽管CTRPs家族成员的结构与脂联素十分相似，但却可以发挥许多不同的作用。近来有报道CTRP3第一个体内功能的研究，即CTRP3是一种维持血糖稳态的代谢调节因子。也有研究报道CTRP3可以在体外促进内皮细胞的增殖及迁移，但是CTRP3在动物体内，在心梗边缘区是否可以促进新生血管的形成，目前尚未见报道。而且，CTRP3作为一种最新发现的脂肪因子家族成员中的重要成员，对心梗后心肌重构会起到促进作用还是抑制作用，迄今尚未进行过相关研究。目标：1）探讨CTRP3体外促进新生血管形成的作用及机制；2）探讨CTRP3是否可以在体内促进心梗边缘区新生血管的形成，及其心肌保护作用的机制；3）探讨CTRP3是否可以促进伤口边缘血管化，从而促进伤口愈合。方法：合成制备CTRP3：PCR法合成CTRP3球形结构域基因序列，在原核蛋白表达载体pET45b中克隆其片段，DNA测序进行验证。体外实验：①成鼠心肌细胞培养：分离野生型小鼠成鼠心肌细胞，血清饥饿，使用Akt阻断剂LY294002阻断心肌细胞中Akt信号通路，阐明CTRP3促进血管化作用的机制。②HUVECs从ATCC购买。③小管形成实验：将HUVECs种植于胶上，无血清培养基培养，之后换成心肌细胞预处理培养基，6小时后观察小管形成情况，Image-Pro5.0软件进行分析，并利用VEGF阻断剂CBO-P11进行阻断研究。④检测生成NO的含量：检测CTRP3对HUVECs生成NO含量的影响。⑤Western blot分析蛋白表达：SDS-PAGE胶分离蛋白，转移至PVDF膜，用相应的抗体孵育，检测关注蛋白的表达。心梗模型：①缝扎小鼠心脏左主降冠状动脉，构建心梗模型。术后恢复后，将小鼠随机分为四组：即空白对照组，空白对照给CTRP3组，手术对照组，及手术给CTRP3组。2周后处死小鼠，在心梗边缘区进行Masson染色、免疫染色和Western blot等方法进行分析。②检测心脏功能：植入腹腔微量给药泵后2周，主要通过心脏超声和血流动力学检测心脏功能。③Masson染色的方法分析心脏梗死面积和胶原含量，切片进行CD31免疫组化染色和αSMA免疫荧光染色，检测血管标志物含量。④Western blot分析关注蛋白的表达。伤口愈合模型：①用打孔器在小鼠背部打直径6mm的孔，每天在创面边缘给CTRP3，剂量为2μg/kg/d，以给生理盐水组为对照，7天后处死小鼠。②观察并测量创面愈合情况及血管形成情况。③对切片进行HE染色，观察血管新生情况。④对切片进行CD31和αSMA免疫染色，检测新生血管形成情况。统计分析：用统计软件Prism进行统计分析，计算每组的均数和标准误，One-wayANOVA与LSD-t检验进行多组间相互比较的统计分析，认为P<0.05有统计学差异。结果： CTRP3不显著促进体外培养的内皮细胞（HUVECs）形成新生血管。体外全长CTRP3及CTRP3球状结构域作用并未见显著促进HUVECs形成管状结构，也没有促进NO的生成。而在体内CTRP3作用可显著激活缺血心肌Akt信号分子，增加HIF1-α及VEGF的表达，但是体外CTRP3作用HUVECs并不增加Akt信号激活，也不增加HIF1-α及VEGF的表达。 CTRP3促血管化作用是通过心肌细胞介导的Akt依赖信号通路实现的。CTRP3预处理的心肌细胞培养基可显著增加HUVECs细胞管状结构的形成，提示CTRP3是通过诱导心肌细胞旁分泌细胞因子促进血管化作用的。而且，CTRP3作用增加了培养心肌细胞中Akt的激活及HIF1-α和VEGF的表达，并且表现为时间和剂量依赖性。此外，我们用Akt抑制剂阻断Akt信号通路时，CTRP3无法增加心肌细胞中HIF1-α和VEGF的表达，预处理的培养基再处理HUVECs时，小管形成也未见增加。而且，当用VEGF特异性阻断剂阻断HUVECs细胞VEGF信号通路时，再用CTRP3预处理的心肌细胞培养基作用HUVECs细胞，不再促进管状结构的形成。外源性补充CTRP3可显著提高心梗后存活率，改善左室功能。外源性给予CTRP3可显著提高动物生存率（P<0.05），而且可将左室收缩功能提高57%，dP/dtmax提高30.4%，左室收缩末压（LVEDP）降低17.6%，P<0.05。 CTRP3作用抑制心梗后左室病理性心肌重构。我们通过大体观察、超声检测及Masson染色等观察心梗14天后心肌重构的程度。给予外源性CTRP3可以减小心脏大小和体积，减小左室舒张末期内径（LVEDD）和左室收缩末期内径（LVESD）。而且，外源性CTRP3作用可显著降低心梗边缘区间质纤维化（与MI+Veh相比降低41%），并显著增加缺血区肌细胞与纤维细胞的比例。 CTRP3在心肌梗死边界区通过激活Akt-HIF1α-VEGF通路促进血管化。我们通过CD31免疫组化染色评价CTRP3促血管化作用，发现CTRP3作用显著增加心梗边界区CD31阳性的毛细血管数量，并且增加α-SMA阳性的小动脉密度。CTRP3对AMPK及eNOs的激活并无明显作用，但是却可以显著激活Akt，增加HIF1α和VEGF表达。这些结果提示这一过程可能激活了Akt-HIF1α-VEGF信号通路。为验证CTRP3心肌保护作用是否是通过Akt-VEGF信号通路，我们在心梗模型的小鼠腹部植入载有Akt抑制剂LY294002和VEGF抑制剂CBO-P11的缓释泵，检测心脏功能及血管密度。与MI+CTRP3组相比，给予小鼠Akt抑制剂后，CTRP3改善心脏射血分数（LVEF）的能力明显受到抑制，促血管化作用也几乎消失。但是，虽然给予VEGF抑制剂和给予Akt抑制剂对CTRP3促血管化作用的抑制效果类似，但是给予VEGF抑制剂只是部分阻断了CTRP3的心脏保护作用。 CTRP3显著抑制心梗边缘区心肌细胞凋亡。TUNEL染色和Caspase3活性检测结果均表明CTRP3可显著减少细胞凋亡坏死。由于目前尚没有CTRP3-KO的小鼠，我们体外将3T3细胞诱导成脂肪前体细胞，用这种预处理的培养基与体外分离的成鼠心肌细胞共培养，验证缺血缺氧损伤时内源性的CTRP3是否可以起到心肌保护功能。提前48h给予诱导的3T3细胞CTRP3小干扰RNA及对照无关小干扰RNA，然后用预处理培养基与成鼠心肌细胞共培养，然后给予成鼠心肌细胞低氧处理（2%O2，12h），检测培养基中LDH释放量及成鼠心肌细胞Caspase3活性。与单独缺氧组（SI）相比，3T3细胞预处理培养基可显著减少成鼠心肌细胞凋亡坏死。而且，用小干扰RNA阻断诱导3T3细胞CTRP3表达后，3T3预处理培养基处理的成鼠心肌细胞释放的LDH含量和Caspase3活性显著提高。 CTRP3可显著促进创面血管化，加速创面愈合。CTRP3作用后3天，即可发现创面愈合速度较对照组显著增快，7天时伤口面积比对照组减小30%。对真皮下血管网拍照，HE染色及αSMA免疫染色分析，发现CTRP3作用可显著增加创面边缘新生血管的形成。结论：我们的研究有几个重要的发现：本研究首次报道了CTRP3促进新生血管形成作用，是通过细胞与细胞之间相互作用的旁分泌途径实现的；本研究首次发现了CTRP3作为一种新发现的脂肪因子家族中的重要成员，可以显著提高心梗边缘区新生血管的形成，抑制心肌细胞凋亡，实现对缺血心肌的保护作用；我们首次发现CTRP3在缺血心肌促进新生血管形成是通过激活了Akt-HIF1α-VEGF信号通路实现的，进一步阐明了CTRP3促进新生血管形成作用的机制，为进一步研究打下坚实基础；我们首先观察到脂肪因子CTRP3可以显著促进创面边缘新生血管形成，从而加速伤口愈合，为促进创面愈合提供了新的治疗靶点。