第一部分转录因子Sox2的泛素连接酶鉴定及其功能研究　　Sox2,转录因子超家族Sox家族成员之一，作为调节胚胎或多能干细胞增殖分化的核心转录因子，它通过特征性的HMG结构域与DNA或其他转录因子Oct4等特异结合，与羧基端的转录激活结构域共同发挥转录因子活性，调控胚胎发育相关的信号通路及下游基因。2006年，日本京都大学的山中伸弥通过逆转录病毒将四个干细胞核心的转录因子Sox2, Oct4, c-Myc, klf4导入小鼠的成纤维母细胞中重编程了具有类似胚胎干细胞特征的诱导多能干细胞,简称 iPS细胞。2007年，美国Thompson实验室和山中伸弥实验室几乎同时报道，利用iPS技术同样可以诱导人皮肤纤维母细胞重编程，所不同的是Thompson实验室采用了以慢病毒载体引入Oct4、Sox2加Nanog和LIN28这种因子组合。　　Sox2, Oct4和Nanog这三个核心转录因子不仅能够维持干细胞多能性，并且参与胚胎干细胞多方向的谱系分化。其中Sox2主要调控胚胎干细胞向神经外胚层的特异定向分化，是调控神经系统发生和神经干细胞分化的重要因子。　　Sox2对于胚胎干细胞向神经系统（中枢神经系统、周围神经系统）的定向分化发育以及成体神经干细胞的自我更新和多能性维持方面作用尤为重要。这种重要性在体内体外均得到了验证：Sox2高表达于神经祖（干）细胞，并且在神经干细胞向神经元和神经胶质细胞分化过程中蛋白水平逐步下调。减少Sox2的表达量，就会阻碍神经干细胞的自我更新和增殖，促进了神经干细胞更早地进入细胞周期，完成终末分化。相反，过表达Sox2会抑制神经干细胞向神经元和神经胶质细胞的分化。事实上，单独过表达Sox2或者结合其他调控神经发育的转录因子可以直接将成纤维母细胞重编程为多能神经干细胞。这些前期研究都表明Sox2在神经干细胞发生以及多能性维持上的必要性，而它蛋白水平的变化会直接影响神经干细胞分化的进行，也就是说Sox2的蛋白水平在此过程一定受到非常严格的控制，那么我们提出的科学问题就是神经干细胞到底是通过什么途径完成Sox2蛋白水平的精细调控，又有哪些分子参加了此调控过程呢？　　泛素-蛋白酶体途径是真核细胞内最主要的蛋白质水平调控途径，需要降解的蛋白质通过结合泛素分子Ub进行泛素化修饰，标记有泛素分子的蛋白质会被特异性识别并定向送到蛋白酶体中迅速降解，从而平衡整个细胞环境中各个蛋白的表达量，维持细胞正常代谢，保持稳态。在泛素化过程中，三种关键的酶逐级传递活化的泛素分子，共同介导了蛋白质的泛素化修饰。这三种酶分别是泛素激活酶 E1，泛素结合酶 E2和泛素连接酶 E3，其中泛素连接酶负责特异识别并结合底物，是泛素分子传递过程的最后环节，也是决定反应特异性的重要环节。E3 的数量庞大，到目前为止已发现的E3大约有1000种左右，基本上可分为两类：RING-finger类E3和HECT类E3。既然E3可以直接结合底物进行泛素化修饰调节靶蛋白水平，而现今对于Sox2的泛素化修饰和其特异的E3分子研究甚少，本课题的研究目的是鉴定能够特异识别结合Sox2并对其进行泛素化修饰调节其蛋白稳定性的E3分子，同时研究该E3分子对神经干细胞的调控功能。　　围绕鉴定调节 Sox2稳定性的E3分子这一科学问题，本课题采取了以下的研究策略：由于E3数量庞大，又分为RING类E3和HECT E3，我选择从包含绝大多数E3的RING类E3进行筛选。而RING类E3基本上以CRLs的这种复合体形式存在，根据其CRLs的支架蛋白Cullin的不同，可以将RING类E3分为Cullin1, Cullin2, Cullin3, Cullin4A, Cullin4B, Cullin5（ CUL1~CUL5）这六大家族。我们通过初步筛选，发现CUL4A可以特异地下调Sox2的蛋白水平，增强Sox2的泛素化修饰。而CUL4A家族是由60个左右的DCAF家族成员构成，在此基础上，本课题通过 DCAF家族进行了第二轮的筛选，结果显示，该家族成员COP1负调控Sox2的蛋白表达水平，减弱 Sox2的转录因子活性，并通过Sox2调节人源神经干细胞分化。人源的COP1基因位于人类染色体1q24.1，其编码的蛋白COP1作为RING类泛素连接酶参与特定底物的泛素化修饰，进一步介导蛋白酶体降解。已报道的COP1底物包括JUN，ETV家族，p53等转录因子。通过本课题的研究，我们进一步的研究发现：　　1、泛素连接酶COP1调控Sox2的蛋白稳定性。　　RING类E3 CUL1~5家族初步筛选，CUL4A特异负调控Sox2的蛋白表达水平，CUL4A-/-小鼠MEF细胞检测Sox2蛋白明显积累，半衰期延长。CUL4-COP1复合体是Sox2特异的泛素连接酶，COP1通过WD40结构域与Sox2特异结合，并与CUL4A,DET1形成E3复合体，以复合体形式发挥E3活性，增强Sox2的泛素化修饰，促进泛素-蛋白酶体降解，抑制Sox2的转录因子活性。由此我们得出结论，泛素连接酶COP1调控Sox2的蛋白稳定性。在2014年Molecular Cell的一篇文章中指出HECT类泛素连接酶WWP2依赖甲基化酶Set7对Sox2119位进行甲基化后特异降解Sox2蛋白。随后我们实验验证，相比WWP2，COP1作为Sox2的泛素连接酶并不依赖Sox2 K119甲基化修饰，可以更加广泛性地调节Sox2的蛋白稳定性。　　2、泛素连接酶COP1调节神经干细胞分化。　　人源神经干细胞WA09分化过程中 CUL4A、COP1蛋白水平逐步上调，与Sox2蛋白表达趋势相反，敲低WA09细胞中的COP1蛋白，Sox2蛋白表达量积累，标记有TUJ1的神经元数量减少，标记有NESTIN的神经干细胞数量相对增多，COP1促进人源神经干细胞WA09的分化。　　我们的研究表明，CRL4A-COP1是Sox2特异的泛素连接酶，是第一个不依赖任何修饰方式直接介导Sox2的泛素化修饰并最终调控Sox2的蛋白稳定性和转录因子活性的泛素连接酶，是 Sox2重要的负调控因子，也是第一次发现 COP1在神经干细胞的分化过程中发挥着重要作用。我们的发现揭示了Sox2蛋白稳定性的重要调控机制，并为深入理解神经干细胞的分化过程提供了新的线索。　　第二部分小分子化合物抑制泛素连接酶SMURF1与泛素的结合增强成骨细胞活性　　HECT类泛素连接酶Smurf1是细胞内影响骨形成，胚胎发育，肿瘤发生等多个生理、生物学过程的关键分子。尤其，Smurf1作为成骨分化的关键信号通路BMP通路的负调控因子，通过靶向通路中的信号转导蛋白Smads家族，介导特异其泛素-蛋白酶体降解，以抑制成骨细胞的活性及骨形成。与RING类泛素连接酶不同，HECT型泛素连接酶Smurf1,通过具有催化活性的HECT结构域结合并转运泛素分子最终使泛素分子与底物结合。Smurf1结合泛素分子是发挥其泛素连接酶的促进底物降解过程中必不可少的环节。换言之，阻断Smurf1泛素分子的结合，降解过程将不能正常进行。然而，到目前为止，还没有鉴定出能够特异调节Smurf1和泛素分子结合的分子或化合物。本课题鉴定了两个能够特异靶向Smurf1 HECT结构域泛素分子结合区的小分子化合物，它们阻断两者结合，从而抑制Smurf1的泛素连接酶活性，从而稳定BMP信号通路中的分子Smad1/5的蛋白水平。另外，这两个小化合物可以进一步激活BMP通路，增强成骨细胞活性。这些发现为进一步研究靶向Smurf1泛素连接酶活性治疗骨代谢紊乱提供了新的策略。