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促分裂素原活化蛋白激酶由RAS/RAF/MEK/ERK组成,是细胞内最重要的信号通路之一。BRAF是RAF三个亚型之一,在3个亚型中突变频率最高。突变的BRAF使下游信号通路持续异常激活,这对肿瘤的生长、增殖、侵袭和转移至关重要。VEGFR-2对肿瘤血管生成起重要作用,其通过激活VEGF将信号传导至下游,导致血管生成,促进肿瘤细胞增殖和迁移。相关研究表明,BRAFV600E和VEGFR-2在肿瘤的发生发展过程中具有协同作用。基于Sorafenib和VEGFR-2激酶晶体复合物结构与我们之前的研究,本文以1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶环为母核设计、合成系列新的化合物,评价化合物的激酶抑制活性、体外细胞活性,为发现活性更高、结构更新颖的BRAFV600E和VEGFR-2双重抑制剂提供实验依据。主要研究工作和结果:1.基于我们之前的研究,对化合物1进一步优化。我们保留了1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶环作为母核,将化合物1结构中的脲基变成咪唑或噁唑环而得到新化合物,我们希望化合物能提高BRAFV600E和VEGFR-2激酶活性。2.主要设计了 2个系列化合物的合成路线。以4,6-二氯-5-嘧啶甲醛为原料,经环化、1-NH烷基化、4-苯氧基取代、水合肼还原、芳基异硫氰酸酯缩合等反应合成1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物(7-11),共40个目标化合物。3.激酶活性测试结果显示,在化合物浓度为1 μM条件下,有6个化合物对BRAFV600E和VEGFR-2都显示出了较强的抑制效果(抑制率>80%),其中8u对BRAFV600E和VEGFR-2激酶IC50值分别为171.5 nM和77.9 nM,活性稍弱于阳性对照药Sorafenib。细胞抗增殖实验显示大部分化合物对A375、HT-29和HUVEC细胞株有很强的抑制作用。4.我们总结出初步构效关系:(1)母核1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶环的NH烷基取代中以甲基为活性最好。(2)苯并噁唑环的活性弱于苯并咪唑环,甲基取代的苯并咪唑环的活性最高。(3)在末端苯环与氨基咪唑之间,碳链的增加使活性降低。(4)末端苯环的对位取代基优于邻位和间位取代。5.化合物8u的激酶选择性测试结果表明,化合物仅对CRAF(抑制率=87.6%)有较好的抑制活性,而对野生型BRAF及其它15种激酶有较弱的抑制作用(抑制率<60%)。这表明化合物8u是一个具有选择性的BRAFV600E/VEGFR-2双重抑制剂。6.细胞迁移实验表明,8u能显著抑制A375和HUVEC细胞的迁移能力,且呈浓度依赖性。细胞周期分析结果显示,8u可诱导A375和HUVEC细胞都阻滞在G0/Gi 期。7.对8u与BRAFV600E和VEGFR-2复合物体系进行了分子动力学模拟和结合自由能分析。8u与BRAFV600E和VEGFR-2的结合自由能都为负值,说明化合物8u都能与它们存在较强的相互作用。能量项的分解表表明范德华力、静电作用和非极性溶剂化对8u与BRAFV600E和VEGFR-2的结合都是有利的,而极性溶剂化能是不利于结合的。