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有一株来源于传统中药柴胡的细胞株在通常紫外线致死剂量1-2倍的情况下,染色体仍然不发生片断化,进一步在大量的柴胡原生质体中利用紫外线高剂量照射筛选,获得一株在致死剂量2-3倍下仍然存活,可以正常形成细胞壁并正常分裂的细胞株,命名为“Anti-UV Clone”。由于植物没有成熟的紫外线损伤模型,本实验利用紫外线照射体外培养的角质形成细胞株(HaCaT细胞),建立紫外线损伤模型,并用MTT检测法和DNA损伤定量试剂盒研究“Anti-UV Clone”提取物对紫外线引起的人角质形成细胞的凋亡和死亡及其DNA损伤的影响,初步探讨了“Anti-UV Clone”提取物的抗紫外线的机理。
通过实验证实,紫外线照射可以导致细胞的凋亡和死亡,60mJ/cm<2>照射后细胞存活率为47.5%,以该照射剂量为细胞的半致死剂量建立了紫外线诱导的HaCaT细胞凋亡模型。
分别用水、乙醇、乙酸乙酯提取“Anti-UV Clone”细胞株有效成分,进行细胞毒性实验及抗紫外线实验表明,对于HaCaT细胞,在不照紫外线的情况下,水提取物对其增殖不但没有抑制,反而有促进作用,浓度为0.15U/ml(20g新鲜细胞提取后浓缩定容至40ml的初提物在217nm处的OD值定为1个单位浓度,即浓度标定为1 U/ml)时效果最好,对细胞的抑制率为-18.4%,明显低于对照组;而乙醇和乙酸乙酯提取物会抑制该细胞的增殖,浓度越大抑制作用越强,使用浓度为0.2U/ml时抑制率最大,达23.5%;对于Hela细胞,三种方法提取的物质都可抑制其增殖,水提取物的抑制率最小,当浓度为0.15U/ml时抑制率为零,乙醇和乙酸乙酯提取物的抑制率与HaCaT基本相同。
三种溶剂的提取物都对紫外线照射的细胞损伤有保护作用,不同浓度保护效果不同,其中水提取物的保护效果最好,使用浓度为0.2U/ml时保护率最大可达35.7%,随浓度的递减保护率也随之递减。而活体涂抹实验的结果正好相反,不管是从涂抹后照射红斑产生的速度和数量来看,还是照射后恢复的速度来看,乙酸乙酯提取物的抗紫外线效果和修复效果都是最好的,乙醇次之,水提取物相对较弱。细胞模型与活体动物皮肤实验结果一致表明,“Anti-UV Clone”细胞株提取物对细胞的紫外线损伤具有保护和修复作用,但不同溶剂提取物的保护效果在离体细胞和活体动物皮肤上的实验结果相反,分析原因可能是有机溶剂提取物中有效成分含量更多,但有机溶剂最终无法被彻底祛除,残留物质容易产生细胞毒性,从而抑制了细胞的生长,而活体豚鼠皮肤由于表层有角质层等天然保护结构,对少量残留溶剂有较强的耐受性,因此表现为乙酸乙酯提取物的保护效率最高。我们的研究表明紫外线辐射对皮肤细胞具有明显的损伤,小剂量UVB辐射可以诱导体外培养的角质形成细胞凋亡,大剂量UVB辐射则导致细胞死亡。“Anti-UV Clone”提取物不但能促进HaCaT细胞生长,还能够减少紫外线造成的DNA损伤,并对光损伤具有修复作用,因此,“Anti-UV Clone”可能在防止皮肤的光损伤和光损伤修复方面具有潜在的应用价值。