论文部分内容阅读
漆酶（EC1.10.3.2）是多铜氧化酶家族中的一种糖蛋白，它利用分子氧通过自由基-催化反应来氧化多种芳香族和非芳香族化合物。漆酶广泛存在于真菌、细菌、动物中，根据其生理作用的差异将漆酶主要分为Ⅰ型（Lac1）和Ⅱ型（Lac2）， Lac1在昆虫脱毒或离子代谢方面发挥着重要的生理作用，而 Lac 2 在昆虫表皮的黑化过程中具有重要作用。本文采用PCR及RACE方法从小菜蛾3龄幼虫中获得漆酶Ⅱ型基因（PxLac2）cDNA全长序列，并进行了分子生物学分析；利用荧光定量PCR对PxLac2在各虫态及虫龄中的相对表达量进行了测定；从小菜蛾蛹皮中粗提取了漆酶溶液，并研究了漆酶的基本酶学特性，本文的研究结果为深入揭示Lac2的生物学功能奠定了基础。研究结果如下： 1、PxLac2序列全长1944bp，包含一个开放阅读框（ORF）为1794bp，一个89bp的5’非编码区（5’UTR）和一个61bp的3’非编码区（3’UTR），由其推导的氨基酸序列以甲硫氨酸为起始氨基酸，长为597个氨基酸，分子量为66.09kDa ，等电点pI为5.23。Lac2 的半衰期为 30 h ，不稳定系数为 32.52 ，是一类稳定蛋白。化学分子式为C2940H4589N789O887S28。 2、通过同源建模建立了三级结构模型，经氨基酸序列分析，检测到有三个铜离子结合域，分别位于67-177、183-325、452-555号氨基酸。此氨基酸序列包含昆虫漆酶所特有的C-X-R-X-C区域。在21位氨基酸存在剪切位点，1~20位氨基酸推测为信号肽，不存在跨膜结构域，α-螺旋占14.41%，随机卷曲占59.63%，它们是Px Lac2最大量的结构元件，延伸链占25.96%。 3、将小菜蛾氨基酸序列与 21 种昆虫漆酶序列比对并进行同源性分析，结果显示， 22条昆虫漆酶序列中均具有特征性序列区HWHG(X)9DG(X)5QCPI。PxLac2与Amyelois transitella Lac1（XP_013194946）、Papilio polytes Lac2（GenBank no. AB531135）、Papilio xuthus Lac2（GenBank no. AB499123）、Papilio machaon Lac2（GenBank no. AB531133）亲缘性较近，且氨基酸同源性分别为61%、54%、56%和63%。 4、Px Lac2 在成虫期相对表达量低，设定为 1.0，在 3 龄幼虫和蛹期表达量较高，分别是成虫的3.41倍和4.84倍；在4龄幼虫、预蛹和成虫期的表达量较低，4龄和预蛹的表达量为成虫的0.7倍和1.27倍。 5、进行漆酶酶学特性分析显示，小菜蛾漆酶的最适温度为35℃，最适p H为3.0，在此条件下测得米氏常数Km为0.97mM，最大反应速率Vm为56.82U/mL。当C u2+终浓度低于 0.8mM 时，对漆酶活力表现为激活作用，高于 0.8mM，表现为抑制作用，IC50为1.26mM。漆酶催化ABTS氧化反应的活化能（Ea）为17.36KJ/mol。