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在体外条件下,研究人雌性生殖细胞产生和成熟的诱导方法,有助于进一步解析生殖细胞发育和卵子发生机制。已有文献报道,在特定诱导条件下,人多能干细胞能够在体外诱导分化为特定的细胞类型和类器官。但是,通过体外诱导得到人卵泡结构和成熟的卵子仍是当前生殖领域的巨大挑战。因此,本研究利用人胚胎多能干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)和人诱导多能干细胞(induced Pluripotent stem cells,iPSCs),通过添加生长因子(hLIF、hSCF、EGF、BMP4)和牛卵泡液(bovine Follicle Fluid,bFF)的三步诱导方法(三步法),体外实现了人多能干细胞经原始生殖细胞样细胞(Primordial germ cell-like cells,PGCLCs)阶段,向卵泡样结构(Follicle-like structures,FLs)分化完成减数分裂的过程,并获得了人卵母样细胞(Oocyte-like cells,OLCs)。具体研究内容和结果如下:1.人多能干细胞的培养及诱导多能干细胞向原始生殖样细胞的诱导分化采用无饲养层培养体系,对人多能干细胞iPSC系TAC153(46,XX)和ESC系H9(46,XX)进行培养。经质量检测,hiPSCs和hESCs多能性和自我更新能力良好。第一阶段,利用原始生殖细胞诱导培养液(primordial germ cell medium,PGC-m),对hiPSCs进行10天的诱导,使其定向分化为PGCLCs,获得诱导的原始生殖细胞(induced PGCs,iPGCs)。在诱导过程中,iPGCs形态逐渐接近于PGCs,并表达原始生殖细胞特异性基因。全转录组测序结果显示,iPGCs中卵泡发育相关基因出现上调。2.原始生殖样细胞向卵泡样结构的诱导分化在第二阶段,将iPGCs置于卵泡诱导培养液(Follicle-like cell medium,FLC-m)继续分化5天。在这一阶段,iPGCs聚集体中形成了诱导的卵泡样结构(induced FLs,iFLs),即原始卵母细胞样和颗粒样细胞。且能够检测到减数分裂基因SCP3和颗粒细胞特异性基因FOXL2的定位表达。3.卵泡样结构向卵母样细胞诱导分化以及三步法诱导体系验证在第三阶段,将收集的iFLs在卵母细胞诱导培养液(Oocyte-like cell medium,OLC-m)中继续诱导10-15天。在诱导过程中,能发现直径50-150μm大小不同的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complexes,COCs)和OLCs等。并且检测到了透明带基因ZP2和ZP3的表达。诱导后期,能观察到具有第一极体和透明带的OLCs。此外,本研究利用hESC系H9对三步法体系进行了验证。有趣的是,部分OLCs出现自发发育至多细胞结构的现象,形态类似于植入前胚胎,且呈DDX4和c-KIT阳性。综上所述,本研究建立了hPSCs体外分化为OLCs的三步法体系,为研究人类雌性生殖细胞的发生机理提供了良好的模型。