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实验背景术后疼痛常给病人带来极大痛苦,尽管越来越多的研究已经增强了对其病理学机制的认识,但是最佳的术后痛治疗手段仍然是医生的一个挑战。之前有研究证明,手术引起TNF-α、IL-1β等多种致炎细胞因子的表达上调参与了术后疼痛的发生。最近有研究发现,趋化因子CXCL12及其受体CXCR4介导的信号通路参与了多种类型慢性疼痛。但是CXCL12/CXCR4信号通路是否也介导术后疼痛的产生至今尚无报道。与炎性痛和神经病理性疼痛相比,术后痛是一种特殊的急性疼痛状态,尤其在脊髓中,其可能包含多种中枢敏化的机制。因此尽管大量的研究已经证明了CXCL12/CXCR4信号通路介导多种类型慢性痛的发生,但是它是否也在术后痛的过程中发挥作用仍需做深入的研究。实验目的本研究采用大鼠足底切口手术,首先观察足底切口对脊髓CXCL12及其受体CXCR4表达的影响,并证明CXCL12/CXCR4信号通路激活在术后痛中的作用。并且,我们对大鼠足底切口引起脊髓CXCL12表达上调的上游信号通路以及CXCR4介导术后痛的下游分子机制做进一步的探索。实验方法1大鼠足底切口术后脊髓中CXCL12和CXCR4的表达变化及分布的细胞类型雄性SD大鼠随机分为实验组(PI组)和对照组(Sham组),连续测量后足机械性撤足阈值(PWT)和热缩足潜伏期(PWL)至术后第7天,利用Western-blot检测脊髓背角CXCL12、CXCR4、p-p65、p-ERK和p-Akt的蛋白表达,并结合免疫荧光双染技术观察CXCL12和CXCR4在脊髓中表达的细胞类型。2阻断CXCL12/CXCR4信号通路对术后痛的作用雄性SD大鼠随机分为6组:Sham组、PI+Saline组、PI+AMD 5μg组、PI+AMD 10μg组、PI+AMD 20μg组和AMD 20μg组,采用术前预先鞘内注药的方式并测量大鼠PWT和PWL,利用Western Blotting检测p-ERK和p-Akt的蛋白表达。另取一批雄性SD大鼠随机分为实验组(PI+CXCL12antibody 4μg组)和对照组(PI+IgG 4μg组),于术前30 min单次鞘内注药,连续检测术后30 min、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h的PWT和PWL。3急性切口痛模型大鼠脊髓中CXCL12表达上调的调控机制雄性SD大鼠随机分为4组:Sham+Vehicle组、PI+Vehicle组、PI+PDTC 0.5μg组和Sham+PDTC 0.5μg组,采用术前预先鞘内注药的方式测量PWT和PWL,并利用Western Blot检测p-p65和CXCL12的蛋白表达情况。4 CXCL12/CXCR4信号通路介导术后痛的下游分子机制本部分前两步已由第1部分和第2部分完成,本部分将进行第3步。雄性SD大鼠随机分为2组:PI+Vehicle组、PI+PD98059 10μg组,采用术前预先鞘内注药的方式并测量PWT和PWL。实验结果1大鼠足底切口引起大鼠痛觉过敏以及脊髓中CXCL12与CXCR4的表达上调左后爪足底切口术(Plantar incision,PI)引起大鼠急性的机械性痛觉超敏和热痛觉过敏。疼痛行为学测试显示大鼠PI术后1小时PWT和PWL开始出现了明显的下降,并持续至术后第5天。Western blotting结果显示PI引起术后脊髓背角中CXCL12与CXCR4的蛋白表达量明显升高。免疫荧光组织化学数据也显示PI引起大鼠术后1天术侧脊髓背角中CXCL12与CXCR4表达量出现明显上调。免疫荧光双染技术证实,术后表达上调的CXCL12主要与神经元marker NeuN和星形胶质细胞marker GFAP共表达,与小胶质细胞marker OX42不发生共表达,而CXCR4只与NeuN发生共表达。2脊髓CXCL12/CXCR4信号通路在诱导术后痛发生中的作用预先鞘内注射CXCR4特异性阻断剂AMD3100或CXCL12中和抗体可以减轻PI引起的机械性异常性疼痛和热痛觉过敏。与溶剂组(i.t.10μl saline)术侧后足相比,AMD3100治疗组(术前30分钟开始鞘内注射并持续5天,每天1次)大鼠术侧后足呈剂量依赖性地升高PWT和PWL,而对侧数值没有明显变化。鞘内注射单剂量CXCL12中和抗体可以明显升高PI术后PWT和PWL。与对照组(i.t.IgG抗体4μg/10μl)相比,实验组PWT和PWL值从术后30 min开始出现统计学差异,并持续至术后16 h。3脊髓NF-κB信号通路的激活调控足底切口术后CXCL12的表达上调Western Blot结果显示p-p65在术后2小时表达水平明显上调并持续至术后第3天,而p65的蛋白总量在术后并没有发生改变。术前预先鞘内注射NF-κB特异性抑制剂PDTC(500 ng/10μl)可以抑制PI引起的CXCL12表达上调。大鼠疼痛行为学测试结果证实鞘内注射PDTC可以有效减轻PI引起的机械性痛觉超敏和热痛觉过敏现象。4脊髓中CXCL12/CXCR4通过ERK信号转导通路介导术后痛PI也可以诱发ERK1/2和Akt在脊髓中磷酸化水平上调。Western Blot结果显示术前预先鞘内注射AMD3100可以显著降低脊髓背角中ERK1/2的磷酸化水平,但是p-Akt的蛋白表达量并没有发生明显改变。疼痛行为学测试结果证实,鞘内注射ERK激酶抑制剂PD98059(10μg/10μl,术前30分钟开始注射并持续5天,每天1次)可以有效阻止PI引起的PWT和PWL下降。实验结论上述结果提示大鼠足底切口术引起脊髓NF-κB信号通路的激活诱导CXCL12表达上调,CXCL12与其受体CXCR4结合并通过ERK信号通路的激活从而介导术后疼痛的发生。