研究目的蜱虫是仅次于蚊类的第二大类媒介节肢动物,具有生命周期长,分布广泛,宿主可选择范围大等特点。经蜱虫可以传播细菌、病毒、螺旋体、立克次体、原生动物和寄生虫等病原微生物,其中不乏对人类和动物具有高度致病性的病原体。随着深度测序技术的飞速发展,将蜱虫病毒组学研究和高通量测序技术相结合,丰富了人们对于蜱虫携带病毒多样性的认知,发现了许多与已知病毒存在巨大差异的新型病毒。为深入了解浙江舟山地区蜱虫携带病毒谱的情况,本课题选择浙江舟山群岛的衢山岛、舟山岛和岱山岛三个岛屿,作为蜱虫采集点,进行蜱虫采集和高通量测序,并对测序发现的病毒谱进行了进一步研究。研究方法和结果1.标本采集及宏基因组测序采集上述三地蜱虫共计421只,蜱虫种类经形态学初步分类后,针对蜱虫线粒体16s核糖体RNA设计特异性引物,PCR鉴定为长角血蜱Haemaphysalis longicornis和镰形扇头蜱Rhipicephalus haemaphysaloides。选取三个采集地点各20只蜱虫进行高通量测序,对测序结果进行整理,结果共计获得23,915,810条读长(reads),经拼接后有10,106,532条reads为重叠序列,42.26%的数据标记含有有效标签。其中有101282条reads被预测为开放阅读框(ORF),病毒reads占0.015%(15/101282),经NCBI核酸数据库比对,经这些病毒reads被确定为4种病毒,均属于布尼亚病毒科白蛉病毒属,其中有3种提示为新病毒,与这3种病毒同源性最高的分别是Bronnoya病毒、MG22病毒和Odaw病毒,还有1种病毒与NCBI上已公布的病毒—Dabieshan病毒同源性高。2.病毒验证根据宏基因测序结果,对发现的蜱携病毒线索进行PCR验证。根据拼接得到的碱基序列,经primer 5.0软件设计针对Rd Rp区域的特异性引物,以验证高通量测序结果的准确性和检测三个采集地点各种病毒的阳性率。PCR结果显示,衢山岛地区并没有检测到上述病毒的存在;岱山岛地区蜱虫检测到三种病毒存在,Bronnoya-like病毒未检测到;舟山岛地区只检测到Dabieshan病毒。3.Dabieshan病毒全序列扩增以NCBI病毒数据库所公布的Dabieshan病毒的基因组序列为标准序列,设计引物,对Dabieshan病毒阳性标本进行序列扩增,成功获取L片段和S片段编码区序列。通过基因组扩增获取DSP4、ZSP7两种病毒的L片段部分基因序列,对以上病毒的基因组序列构建进化分析树,分析发现四种病毒均属于白蛉病毒属,但与已知的白蛉病毒属病毒位置上相距较远,属于新的分组。4.Dabieshan病毒多克隆抗体制备及应用在获得Dabieshan病毒S片段的基因组信息的基础上,制备S基因片段所编码的核衣壳蛋白nucleocaspid protein(NP)的重组蛋白,免疫Balb/c小鼠和新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用重组NP蛋白作为固相抗原,建立间接ELISA的方法,用于分析该地区人群血清中相应病毒抗体滴度分布状况,但ELISA检测结果显示,人群血清病毒抗体滴度水平低,无法确定是否存在人群间差异,需要进一步完善ELISA方法和扩大人群检测范围。结论本研究通过高通量测序技术发现4种新型病毒,并设计特异引物对蜱虫携带Dabieshan病毒、ZSP7病毒和DSP4病毒进行阳性率统计,阳性率分别达33.2%(81/244),0.41%(1/244)和1.2%(3/244)。通过对Dabieshan病毒核衣壳蛋白(NP)进行重组表达,建立起以NP为固相抗原的间接ELISA方法,对舟山地区和盐城地区人群血清进行检测,并未发现存在显著性差异。基于高通量测序技术的病毒组学研究极大地提高了已知病毒检测的准确性和未知病毒探究的效率。通过与特异性PCR技术的结合,使得蜱虫病毒组学研究变得有针对性,降低了实验的盲目性,极大地提高了科研实验的效率。利用Dabieshan病毒的重组NP蛋白构建间接ELISA方法进行人群血清学分析,有利于了解该地区是否存在Dabieshan病毒的既往感染,从而分析该地区是否存在该病毒经蜱虫传播给人类的病例,对于明确该病毒的致病力,是否为人兽共患病病毒提供流行病学方面的背景资料。该研究对掌握该地区蜱虫携带病毒的多样性具有重要意义,有利于对该地区蜱传病毒做到及时监视,及早预防,为该地区人畜健康和安全提供技术参考。