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目的:子宫颈癌是全球妇女发病率仅低于乳腺癌的第二个最常见的恶性肿瘤。宫颈癌的致病因素比较明确,人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染已被确定是高危因素,尤以HPV16和18型最常见。HPV E6、E7癌基因整合到宿主细胞后,分别与p53和pRb结合,导致这两种抑癌基因失活,改变了细胞生长周期的调控机制,引起宿主细胞永生化,最终引起宫颈癌。研究发现,Notch信号通路在维持细胞增殖、分化和凋亡之间的平衡起着至关重要的作用,与人类恶性肿瘤的发生密切相关。数十年前在宫颈癌的相关研究中检测到Notch1,提示其在宫颈癌中可能发挥作用。从宫颈癌前病变发展到浸润癌的过程中,Notch受体及其配体Jagged1蛋白水平升高。Notch1协同HPV E6和E7癌基因促进宫颈鳞状上皮细胞恶变。但是也有研究表明Notch1在宫颈癌中具有抑癌作用,其双重作用可能与Notch1浓度和宫颈病变不同阶段有关。Notch信号激活对上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的启动至关重要,EMT发生过程中上皮细胞经过形态变化,转化为间质细胞,降低细胞间的黏附能力和增加其运动能力,使细胞迁移能力增加,抑制细胞凋亡并加强侵袭能力,与肿瘤的发生、侵袭和转移关系密切。此外,Notch信号与其他信号,如Wnt/β-catenin、TGF-β、PI3K/Akt通路存在交互作用,通过不同机制对Notch信号通路进行调节。本研究将了解Notch信号通路在宫颈癌病变过程中可能发挥的作用,以及与HPV的相关性,旨在探讨Notch信号通路与HPV感染在宫颈病变进展中潜在的作用机制,并欲求寻找能阻断抑制宿主细胞分化的关键分子,为探索宫颈癌防治新策略和新靶点提供实验依据。方法:1建立人宫颈癌裸鼠移植瘤模型。体外培养HPV16阳性的人宫颈癌细胞SiHa。扩增并提取小干扰RNA(miRNA)质粒,包括HPV16E6-miRNA、HPV16 E7-miRNA干扰质粒和1个阴性对照Neg-miRNA空白质粒。将SiHa细胞接种到BALB/c裸鼠右前腋窝中部外侧皮下,待肿瘤体积约为80~120mm3,根据成瘤情况32只裸鼠随机分为4组,包括2个对照组,即生理盐水组(简称盐水对照组)和空质粒组(Neg-miRNA组),2个治疗组,即HPV16 E6基因沉默组(HPV16E6-miRNA组)和HPV16E7基因沉默组(HPV16 E7-miRNA组)。利用体内转染方式,定期定量对4组裸鼠分别行瘤内多点注射生理盐水、Neg-miRNA、HPV16E6-miRNA、HPV16 E7-miRNA,每隔2天注射一次,共注射9次,每次注射前测量肿瘤体积,肿瘤生长情况,最后一次给药48小时后处死裸鼠,及时移植瘤取材,测量移植瘤体积径和重量,分装标本。2取材后提取RNA,采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测方法检测SiHa细胞宫颈癌裸鼠移植瘤中目的基因的mRNA水平,包括Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB。3收集2014年3月至2015年12月在河北医科大学第二医院因宫颈病变行阴道镜活检或手术的宫颈组织,及时放入4%多聚甲醛固定,后放置4℃冰箱保存备用。其中宫颈病变包括低度宫颈上皮内瘤变(LSIL)16例和高度宫颈上皮内瘤变(HSIL)27例,术前未进行放化疗的宫颈癌组织共21例,其中包括鳞状细胞癌18例、腺癌3例,术前行新辅助化疗的宫颈鳞癌5例、宫颈腺癌2例以及宫颈腺鳞癌1例,根据2009年FIGO分期包括IA期6例,IB期13例,IIA10例,同时期收集因子宫肌瘤或子宫腺肌症行全子宫切除的宫颈标本共10例作为对照组。所有病例均采用罗氏Cobas 4800 HPV检测系统,通过实时PCR对14种高危型HPV DNA进行扩增和检测,包括HPV16、18和其余12种亚型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66及68)。对照组术前TCT检查除外宫颈病变,HPV检测结果为阴性,术后病理显示宫颈无异常。收集所有手术病人的基本信息、HPV结果和完整的病理结果。所取宫颈组织经河北医科大学第二医院伦理会批准及患者和/或家属知情同意。4人体宫颈组织标本采用免疫组织化学方法检测目的基因的蛋白表达情况,包括Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB。分析Notch信号通路对EMT和宫颈癌发病过程的影响。结果:1成功建立裸鼠皮下移植瘤1.1裸鼠全部存活,成瘤潜伏期约为30天,肉眼可见明显移植瘤,体积约80~120mm3,外形不规则,个别瘤体可出现溃破和出血,剥离瘤块见瘤体质硬,切面灰白色坏死灶,未见明显血管生成,成瘤率为100%。1.2通过体内转染方式分别沉默HPV16 E6和E7基因,两个治疗组裸鼠移植瘤在小鼠被处死前的体积和肿瘤重量均小于两个对照组,P<0.05,差异有统计学意义。1.3各组宫颈癌裸鼠移植瘤Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB的mRNA水平采用Real-Time PCR分别检测4组移植瘤中目的基因的mRNA的表达水平。HPV16 E6基因沉默组和HPV16 E7基因沉默组分别与空质粒组和盐水对照组比较,Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB mRNA表达水平均降低,P<0.05,差异有统计学意义。空质粒组与盐水对照组比较,Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB mRNA的表达水平无差异,P>0.05,无统计学意义。说明SiHa细胞宫颈癌移植瘤中的HPV16 E6/E7基因沉默后,Notch信号转导途径受抑制。2人体宫颈组织标本分析2.1高危型HPV(high-oncogenic risk HPV,hr-HPV)感染率hr-HPV感染检出率随着宫颈病变的进展升高。正常对照组无hr-HPV感染;LSIL组织中hr-HPV阳性率1.25%(2/16);HSIL组织中hr-HPV阳性率88.89%(24/27);宫颈癌组织中hr-HPV阳性率100%(29/29)。hr-HPV感染率以HPV16阳性为主(45/55),其次为HPV18阳性(4/55)。2.2 Notch信号通路Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB蛋白的表达在正常宫颈上皮和LSIL组织中,Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白表达均较弱;而HSIL组中,上述5种目的蛋白表达为阳性;宫颈癌组织中,Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白表达强阳性。Notch信号通路中Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白的表达在宫颈病变进展过程中逐渐增多,LSIL上述5种目的基因的蛋白表达与宫颈癌比较,P<0.05,差异有统计学意义。术前进行新辅助化疗的宫颈鳞癌组织中上述蛋白表达较未行化疗的宫颈鳞癌组织明显减少,5种目的基因的蛋白表达比较,P<0.05,差异有统计学意义;而宫颈腺癌组织术前化疗与未化疗比较,上述蛋白表达无明显变化,但因样本例数小(2例),无法进行统计学分析。认为术前行新辅助化疗可以降低宫颈鳞癌组织Notch信号通路中Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白的表达,而对宫颈腺癌组织中目的蛋白表可能无明显影响。结论:1成功建立了SiHa细胞宫颈鳞癌裸鼠皮下移植瘤模型,并利用RNA干扰技术证明HPV16 E6-miRNA和HPV16 E7-miRNA能够有效抑制移植瘤生长,RNA干扰技术可用于宫颈癌的体内研究;2沉默HPV16 E6/E7基因抑制小鼠移植瘤生长的效应,可能通过下调Notch信号通路的主要基因Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB而发挥作用;3 Notch信号通路中主要基因Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白的表达随宫颈病变进展而逐渐增多,Notch信号通路参与宫颈癌发生;4术前行新辅助化疗可以降低宫颈鳞癌组织Notch信号通路中Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白的表达,而对宫颈腺癌组织中目的蛋白表可能无明显影响。