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铁皮石斛(Dendrobium officinale)为兰科石斛属多年生附生草本植物,被认为是石斛中的上品,在我国已经有两千多年的用药历史,多糖作为其主要有效成分具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等多种功效,而目前对其生物合成途径还知之甚少。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-Glucose pyrophosphorylase,UGPase),是糖代谢的重要酶类之一。本文以铁皮石斛组培苗为材料,利用简并引物及RACE技术克隆铁皮石斛尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)cDNA全长及DNA片段,利用荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测了该基因在根、茎、叶各组织中的表达情况,并分析了该基因的表达与铁皮石斛多糖含量之间的相关性,同时还使用DNAMAN、MEGA、CodonW等生物信息学工具对所获得序列进行分析,以期为进一步研究该基因的功能与调控及了解铁皮石斛多糖生物合成途径奠定基础。本文所取得的主要结果如下: 1.克隆获得铁皮石斛UGP cDNA全长序列,长度为1643bp,命名为DoUGP,Genbank登录号为KF711982;克隆获得铁皮石斛UGP基因长度为1697bp的DNA片段,Genbank登录号为KJ645095。 2.qRT-PCR结果显示,DoUGP在铁皮石斛的根、茎、叶中均有表达,其中根和叶中的表达量较低,而茎作为多糖含量较高的药用部位其DoUGP的表达量最高;不同浓度蔗糖诱导处理结果表明,随着DoUGP表达量的提高,多糖含量也随之增加,两者呈现正相关关系,推测DoUGP在铁皮石斛多糖生物合成中起到重要作用。 3.生物信息学分析表明,DoUGP包括1419bp完整开放阅读框(ORF)、57bp5非编码区及167bp3非编码区,共编码472个氨基酸;DNA片段包括6个外显子和4个内含子。预测Do UGP编码蛋白的分子量为52kD,等电点为5.08,无信号肽和跨膜区域,暗示该蛋白定位在胞质中。 4.密码子偏好性分析表明DoUGP基因偏好使用A/T结尾的密码子,27种偏好密码子(RSCU>1)中偏好性较强的有TAA和CCU(RSCU≥2)。与其他物种UGP基因同义密码子相对使用度对比后推测出UUG、AUU为最佳密码子。将DoUGP与3种代表生物基因组密码子使用频率比较发现,与大肠杆菌基因组密码子使用频率差值较大的有23个,与酵母和拟南芥基因组差值较大的均有13个,表明DoUGP基因与酵母和拟南芥基因具有更相似的密码子偏好性,预示着DoUGP基因在真核生物酵母和拟南芥中的表达效率高于在原核生物大肠杆菌中的表达。