论文部分内容阅读
本研究拟通过向大鼠纹状体内移植转GDNF基因温度敏感型永生化神经前体细胞系(RMN)，观察转基因神经前体细胞对6-OH-DA诱导的大鼠帕金森病(PD)模型的治疗作用，同时观察过表达GDNF基因对移植到纹状体的温度敏感型神经前体细胞系向各神经细胞亚型分化的影响。研究方法为先在体外培养RMN细胞，并用携带GDNF基因的逆转录病毒转导、嘌呤霉素抗性培养获得稳定表达GDNF的RMN-GDNF细胞；用免疫组化染色、RT-PCR等方法鉴定后，再用携带EGFP的质粒DNA转染细胞，经潮霉素抗性筛选培养后最终获得表达EGFP的RMN-GFP及RMN-GDNF-GFP细胞系；将这种细胞分别植入制备的PD大鼠模型纹状体内。移植前后动态观察阿扑吗啡(APO)诱导的大鼠旋转行为变化；移植后于第2周、4周、8周、16周、24周进行脑组织黑质部位酪氨酸羟化酶(tyrosinehtroxylase，TH)免疫组化染色，高效液相色谱电化学方法检测纹状体内多巴胺(DA)及其代谢产物3,4-二羟苯乙酸(DOPAC)的含量，纹状体部行GDNF、nestin、SV40、β-tublinⅢ、GFAP、Gal-c以及TH免疫荧光染色，观察它们与细胞报告基因GFP双标情况。本研究结果显示，利用脂质体介导的质粒DNA转染EGFP基因并经抗性筛选后，神经前体细胞RMN表达GFP的阳性率为70.42±2.31％(RMN-GFP)；同样经过转基因处理，成功建立携带治疗基因的细胞系RMN-GDNF-GFP；将细胞RMN-GDNF-GFP和RMN-GFP植入纹状体后能够在脑内存活至少达16周，能与周围脑组织良好整合，没有出现组织增生及结构紊乱情况，没有肿瘤形成及剧烈免疫排斥反应发生；2周时可见细胞位于移植部位无明显迁移，4周可观察到GFP阳性细胞向周围扩散迁移，16周最远迁移0.3mm，无明显趋向性；转GDNF基因的细胞RMN-GDNF-GFP在脑内能表达GDNF，表达时间长达16周，其中稳定表达时间为8周；移植后24周内能够显示有促进黑质TH阳性神经元存活及保护存活DA能神经元功能的征象，使纹状体内DA及其代谢产物含量提高(P＜0.01)；PD大鼠的旋转行为得到改善(P＜0.01)，以8周时改善最为显著，旋转降至移植前的69.95％。未转GDNF的永生化神经前体细胞RMN-GFP移植也起到一定治疗作用，表现为在移植后4周内对TH阳性神经元有保护作用，4至12周期间有改善PD大鼠旋转行为的效果(P＜0.05)，但疗效明显差于植入RMN-GDNF-GFP细胞的效果。在RMN-GDNF-GFP细胞在脑内存活期间，可见细胞带有的SV40仍持续表达，nestin在4周时表达率显著降低；细胞似有向神经元(β-tublin阳性)和星形胶质细胞(GFAP阳性)方向分化的趋势，至4周时分化明显；在各时间点上与RMN-GFP相比，这种分化率无统计学差异；8周时检测到移植细胞有分化为TH阳性神经元的现象，分化率为1.05±0.61％。通过上述结果可以认为，转GDNF基因的温控型永生化神经干细胞脑内移植后存活良好，有一定的迁移能力，对中脑残存TH阳性神经元有显著保护作用，使大鼠PD症状明显改善。因此，本实验室建立的温控型永生化神经前体细胞系是基因治疗PD的适宜基因运载细胞，它可以在大鼠脑内分化，但分化还较局限，且主要分化为星形胶质细胞，少数属早期神经元，极少分化为TH阳性神经元；过表达GDNF未能显著促进神经前体细胞分化为神经元，但可促进β-tublinⅢ阳性细胞分化为TH阳性细胞。