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鼻咽癌是东南亚及我国东南沿海地区常见的一种恶性肿瘤。虽然目前肿瘤综合治疗技术已取得长足进步,但是鼻咽癌放疗后的局部复发和远处转移仍然是局部晚期鼻咽癌失败的主要原因。究其原因主要与鼻咽癌细胞对放射线的敏感性有关。目前放射治疗仍然是鼻咽癌首选的治疗方式,其治疗方案的选择依然按照肿瘤的TNM分期。但由于鼻咽癌细胞内在的异质性,即使同一个肿瘤内的不同细胞对放射线的敏感性也不同。随着精准治疗时代的到来,越来越多的研究者正在探索对恶性肿瘤的治疗及预后有预测价值的生物标志物,以便为肿瘤患者制定个体化的治疗方案。因此,探索对鼻咽癌放射敏感性有预测价值的生物指标,来指导鼻咽癌的个体化治疗,是目前研究的热点。电离辐射(ionizing radiation,IR)和/或细胞毒性药物引起的DNA双链断裂(DNA double strand break,DDSB)是DNA最严重的损伤,它的修复与放射敏感性密切相关。RPA是HR修复通路中重要的一员,它与ssDNA结合,防止其形成二级结构,以便RAD51与ssDNA结合,启动HR。有研究发现,RPA的表达与食管癌、胃癌、肝癌、结肠癌的预后相关,RPA表达越高,肿瘤的预后越差。RPA1是RPA三聚复合体中最重要的一个亚基。有研究发现,下调了 RPA1在食管癌TE-1细胞中的表达较对照组的放射敏感性明显增加。提示了 RPA1可能对肿瘤的放射敏感性有预测价值。RPA1在鼻咽癌中的表达尚不清楚,是否能够预测鼻咽癌的放射敏感性,还有待研究。目的:探讨RPA1对鼻咽癌放射敏感性的影响及其机制。方法:(1)收集鼻咽癌患者的临床病理资料,根据治疗前后的影像学检查,参考实体瘤评价标准,分为放射敏感组(完全缓解,CR)及放射抵抗组(未达到完全缓解,nCR)。采用RT-PCR和免疫组织化学方法分别检测24例和182例鼻咽癌患者癌组织中RPA1 mRNA和蛋白质的表达水平,分析其与临床病理特征及放化疗后近期疗效之间的关系。(2)通过慢病毒介导的RPA1-shRNA转染CNE-2R细胞,加入嘌呤霉素进行筛选,采用RT-PCR、WB和免疫荧光分别检测RPA1 mRNA和蛋白质的表达情况,筛选出RPA1稳定下调的CNE-2R细胞株。对各组细胞给予电离辐射后,采用CCK8实验、克隆形成实验、彗星实验、流式细胞术分别检测RPA1对CNE-2R细胞增殖、放射敏感性、DNA损伤修复、细胞周期及凋亡的影响;通过裸鼠荷瘤模型研究RPA1下调联合电离辐射对肿瘤生长的影响。(3)采用WB、免疫荧光实验分别检测电离辐射后不同时间点RPA1、RAD51、y-H2ax蛋白表达及RAD51、y-H2ax聚焦点的形成。结果:(1)RPA1主要在鼻咽癌细胞的胞核中表达,nCR组多为高表达,CR组多为低表达或不表达;RPA1低表达者中达CR者64例(68.09%),明显高于 nCR 者(χ2=15.860,P=0.000);RPA1 蛋白的表达仅与鼻咽癌的放射敏感性有关(p<0.05);多因素分析结果显示,鼻咽癌放疗后近期疗效除了与EBV有关外,RPA1是另一个预测因素(HR3.755,95%CI1.990-7.085)。(2)三条慢病毒介导的RPA1-shRNA分别转染CNE-2R细胞后,RPA1-shRNA1抑制最为明显。CCK8实验显示RPA1-shRNA组的细胞增殖能力较对照组明显减低(P<0.05);经过10Gy-IR后,两组细胞的增殖能力均降低,而且RPA1-shRNA组细胞的增殖能力减低得更加明显(P<0.05)。克隆形成实验显示:RPA1下调后RPA1-shRNA组细胞的克隆形成数明显少于NC-shRNA组(P<0.05),放射增敏比为1.21;彗星实验结果显示,1OGy-IR后30min,两组细胞的彗星尾巴都很明显,彗尾长度无明显差异(P>0.05);6h后NC-shRNA组细胞的彗尾消失,而RPA1-shRNA组还很明显(P<0.05)。流式细胞术结果显示,10Gy-IR后,RPA1-shRNA组的细胞处于G2/M期的细胞明显多于NC-shRNA(P<0.05),RPA1-shRNA组凋亡的细胞数较NC-shRNA组明显增多(P<0.05)。裸鼠荷瘤实验结果显示,RPA1-shRNA组细胞的肿瘤体积明显小于对照组的肿瘤体积(P<0.05);接受6Gy-IR后,两组细胞生成的肿瘤的生长速度均减慢,肿瘤体积均小于未照射组,而且RPA1-shRNA组细胞形成的肿瘤体积生长更加缓慢(P<0.05)。两组细胞形成的肿瘤的质量具有相同的趋势。(3)WB 实验结果显示,10Gy-IR 后 1h,RPA1-shRNA 组 RAD51蛋白的表达明显低于对照组(p<0.05),y-H2ax蛋白的表达与对照组比较无明显变化(p>0.05);6h后两组细胞RAD51蛋白的表达均明显减弱(p>0.05),但RPA1-shRNA组γ-H2ax蛋白的表达较对照组明显增高(p<0.05)。免疫荧光实验结果显示,10Gy-IR后1h,RPA1-shRNA组RAD51的聚焦点的数目较对照组明显减少,6h后RPA1-shRNA组RAD51的聚焦点几乎消失,而对照组仍可清晰看到;但是6h、12h后RPA1-shRNA组y-H2ax的聚焦点仍可清晰可见。结论:1.RPA1下调增加了鼻咽癌细胞的放射敏感性。2.RPA1下调减缓了电离辐射诱导的鼻咽癌细胞的增殖;引起了细胞周期G2/M期阻滞;增加了电离辐射诱导的鼻咽癌细胞的凋亡。3.RPA1影响CNE-2R细胞放射敏感性的机制可能是RPA1下调减少了损伤部位RAD51的募集,阻断了损伤的DNA的修复。