研究背景胃肠黏膜损伤是多种胃肠道疾病的病理基础之一,而胃肠粘膜有自身修复能力,该修复过程包括细胞迁移、细胞增殖、细胞凋亡、粘膜重建等多个环节。早期粘膜损伤快速修复是上皮细胞迁移并覆盖损伤区域的过程,该过程受多种因素调节,如多胺、三叶草蛋白、生长因子、黏蛋白、前列腺素等。在小肠上皮细胞(IEC-6)的研究表明,多胺信号通路是上皮细胞迁移的重要调控因素；在小肠上皮细胞迁移过程,多胺、钾通道蛋白、细胞膜电位等钙离子(Ca2+)调控的上游指标可增加Ca2+内流驱动力,以提高胞内游离钙离子浓度([Ca2+]cyt)而促进细胞迁移；胞内钙库调节指标如磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)、(1,4,5)-三磷酸肌醇(IP3),钙通道蛋白如瞬时受体电位通道蛋白-1(TRPC1)等调控了[Caz+]cyt;Ca2+又作用于下游靶点如Rho GTPase、细胞骨架蛋白myosinⅡ等而促进细胞迁移；Ca2+调控是上皮细胞迁移过程多胺信号通路的关键因素。脾虚患者可见胃肠粘膜损伤的病理改变,益气健脾是脾虚证的主要治则,益气健脾代表方剂四君子汤有防治胃肠粘膜损伤的作用。本课题组前期研究表明,益气健脾中药黄芪、白术、党参、甘草的提取物(如糖提取物、黄酮提取物等)可促进IEC-6细胞迁移,作用机制与其影响多胺信号通路有关,多糖组分是益气健脾中药促进细胞迁移的药效成分之一。研究目的观察四君子汤多糖对小肠上皮细胞(IEC-6)迁移多胺信号通路Ca2+调控的影响,探讨益气健脾代表方剂四君子汤促进胃肠粘膜损伤修复的作用机制,为其治疗胃肠粘膜损伤病变的疗效机制研究提供科学依据。研究方法(1)四君子汤多糖提取分离纯化：四君子汤经水提醇沉、sevag法去蛋白、DEAE-52纤维素柱层析,分别得到四君子汤总多糖、粗多糖、纯化多糖；苯酚-硫酸法检测3种多糖样品的多糖含量；HPLC法对四君子汤纯化多糖进行纯度分析。(2)受试药筛选及剂量确定：在IEC-6细胞迁移模型下观察四君子汤总多糖、粗多糖、纯化多糖对细胞迁移的影响,筛选出细胞迁移药效较好的多糖样品为本研究受试药。细胞实验设正常对照组,阳性对照药精脒组(5μmol·L-1),四君子汤多糖40、80、160mg·L-1组(4-AP负荷实验设四君子汤多糖20、40、80 mg·L-1组)；DFMO或4-AP负荷实验设正常对照组,DFMO或4-AP模型组,精脒组和受试药组同时加入DFMO或4-AP。(3)细胞迁移实验：细胞划痕损伤法造细胞迁移模型,相差倒置显微镜观察细胞迁移情况。(4)柱前衍生HPLC法测定细胞内多胺(精脒和精胺)含量。(5)RT-qPCR法检测Kv1.1、PLC-γ1、TRPC1 mRNA表达。(6)Western Blot法检测Kv1.1、PLC-γ1、TRPC1、RhoA、Rac1、Cdc42蛋白表达。(7)流式细胞仪检测细胞膜电位、[Ca2+]cyt。(8)酶联免疫法检测IP3含量。(9)Pulldown assay法检测GTP-RhoA、GTP-Rac1、GTP-Cdc42蛋白表达。(10)免疫荧光法检测myosinⅡ蛋白表达。研究结果(1)四君子汤多糖提取分离纯化及药效追踪结果：①四君子汤总多糖、粗多糖、纯化多糖的得率分别为5.42%、4.19%、2.44%；②四君子汤总多糖、粗多糖、纯化多糖的多糖含量分别为67.9%、72.4%、81.6%。③药效追踪结果提示四君子汤3种多糖样品均能促进细胞迁移；因四君子汤纯化多糖药效最佳,故确定其为本研究后续实验受试药,实验剂量设为20 mg· L-1～160 mg· L-1,有效剂量40 mg·L-1～160 mg·L-1。(2)四君子汤多糖对细胞迁移的影响：能促进细胞迁移,逆转DFMO(多胺合成抑制剂)负荷所致的细胞迁移抑制；提示四君子汤多糖促进细胞迁移的作用与影响多胺有关。(3)四君子汤多糖对细胞迁移多胺信号通路Ca2+调控上游指标的影响：①能提高细胞内多胺(精脒、精胺)含量,可逆转DFMO所致的细胞内多胺(精脒、精胺)含量降低。②能提高钾通道蛋白Kv1.1 mRNA和蛋白表达,可逆转DFMO负荷所致Kvl.1mRNA和蛋白表达抑制；③可逆转4-AP(钾通道蛋白抑制剂)负荷所致的细胞迁移、Kv1.1 mRNA和蛋白表达抑制；④能提高细胞膜电位以增加细胞膜电位超极化,可逆转DFMO所致的细胞膜电位去极化。提示四君子汤多糖可通过提高细胞多胺含量、激活钾通道、增加细胞膜电位超极化,从而提高Ca2+内流驱动力。(4)四君子汤多糖对细胞迁移多胺信号通路Ca2+调控的影响：①能增加细胞内[Ca2+]cyt,可逆转DFMO所致的[Ca2+]cyt降低；②能提高钙通道蛋白TPRC1 mRNA和蛋白表达,能逆转DFMO所致的TPRC1 mRNA和蛋白表达抑制；③能提高胞内钙库动员指标PLC-γ1 mRNA和蛋白表达以及IP3含量,可逆转DFMO所致的PLC-γ1 mRNA和蛋白表达抑制以及IP。含量降低；④若使用无Ca2+培养液以去除细胞外Ca2+,则不但空白对照组出现显著的细胞迁移抑制,且四君子汤多糖促进细胞迁移的作用也明显弱于使用含Ca2+培养液时。提示四君子汤多糖可通过促进Ca2+内流和胞内钙库动员两途径以增加[Ca2+]cyt,又以前者作用更明显。(5)四君子汤多糖对细胞迁移多胺信号通路Ca2+调控下游靶点的影响：①不但能提高Rho GTPase(RhoA、Rac1、Cdc42)总蛋白表达,逆转DFMO负荷所致的RhoA. Rac1、Cdc42总蛋白表达抑制；还能提高Rho GTPase激活形式的GTP-RhoA、GTP-Rac1、 GTP-Cdc42蛋白表达；②能提高细胞骨架myosinⅡ蛋白表达,逆转DFMO所致的myosinⅡ蛋白表达抑制。提示四君子汤多糖可通过作用于Ca2+下游指标如Rho GTPase和myosinⅡ以影响细胞骨架重排而促进细胞迁移。研究结论四君子汤多糖可通过作用于多胺信号通路而促进IEC-6细胞迁移,钙离子调控是其关键指标之一；多糖组分是四君子汤促进小肠上皮细胞迁移的主要药效成分之一；研究结果为探讨四君子汤胃肠粘膜保护机制提供了参考。