研究背景：　　近年来，乳腺癌的发病率已经上升为中国女性肿瘤首位，严重威胁了女性的身心健康。目前，乳腺癌的治疗仍以手术为主，辅以化疗、放疗、内分泌治疗及靶向治疗等。随着社会发展及女性对形体美学的追求，越来越多的女性希望在治疗疾病的同时保留乳腺。新辅助化疗是对临床分期为Ⅲ期，或虽然临床分期为Ⅱ期，但希望缩小肿块、降期保乳的患者在术前进行的全身化疗，以提高手术切除率及保乳率。与其它化疗一样，新辅助化疗存在的一个主要问题是化疗抵抗或称耐药，这不仅降低了化疗药物疗效，还可能增加了药物全身毒副作用。　　超声化疗（sonochemotherapy）是目前学术界研究的热点。其可能的机制是超声激励微泡空化核空化，引起细胞膜上暂时性的孔隙形成，即声孔效应，导致辐照靶区微血管壁及细胞膜通透性增高，化疗药物借此间隙进入肿瘤细胞或组织的量增加，从而起到增敏化疗的作用。但目前大部分研究仅局限于离体细胞及动物实验，仅有一项将超声化疗运用于晚期胰腺癌的临床研究报道。此外，大量关于超声空化参数的研究中，对于脉冲重复频率（pulse repetition frequency, PRF）与空化效应强度之间关系的结论不一，学术上尚未达成共识。因此，本研究使用乳腺癌动物模型比较不同声学参数（主要变化PRF）辐照对肿瘤组织内化疗药物浓度的影响。同时，通过采用诊断超声仪激励微泡联合新辅助化疗的方式对乳腺癌病人进行超声化疗，希望进一步缩小肿块，以提高手术切除率及保乳率为目的，探讨该治疗方法的安全性和可行性。　　目的：　　1、探讨在相同占空比情况下，观察比较不同声学参数（主要变化 PRF）对超声增敏治疗中化疗药阿霉素在肿瘤局部释药的影响。　　2、探讨诊断超声激励微泡对乳腺癌新辅助化疗可能产生的增强作用，以及该方法的临床可行性和安全性；　　材料与方法：　　一、诊断超声激励微泡增强裸鼠乳腺癌化疗的基础研究　　1.实验材料　　1.1.超声诊断仪：VINNO 70超声诊断仪（飞依诺科技有限公司，中国苏州）,配备VFlash软件，为微泡空化调控组件，即在二次谐波造影成像模式下对电子相控阵电路调节，从而对声波频率、脉冲重复频率、脉冲宽度及脉冲时间等参数进行人为设定，同时配备自适应相控可变焦域技术，将超声能量相对聚焦于设定的聚焦区内。　　1.2. 实验动物：40 只健康雌性裸鼠，4 周龄，由陆军军医大学新桥医院试验动物中心提供。　　1.3. 实验试剂：脂氟显脂质微泡造影剂，由陆军军医大学新桥医院超声科提供，性状为白色粉末，为脂质外膜包裹全氟丙烷(C3F8)，微泡浓度（4~9）×109/ml，微泡平均直径2μm，其中98%微泡直径小于8μm。盐酸阿霉素，由湖北省中龙集团生产。　　2.实验方法　　2.1.建立动物模型：对人乳腺癌T47D细胞进行常规复苏、传代，取对数生长期细胞，消化后以无菌磷酸缓冲盐溶液重悬，调整至细胞浓度为（2~7）×106/ml的细胞悬液。皮下注射0.1ml细胞悬液于裸鼠一侧后肢内侧，建立裸鼠异位乳腺癌模型。　　2.2.实验分组：40只荷瘤裸鼠随机分为四组，每组样本量均为10只。其中A、B、C三组为不同脉冲重复频率组，D组为假照组。A、B、C三组脉冲重复频率参数分别为：A组PRF=10Hz、B组PRF=30Hz、C组PRF=50Hz；余超声参数相同，均为占空比0.5‰、频率5MHz及机械指数0.31。　　2.3. 超声治疗方法：各组经尾静脉缓慢推注阿霉素10mg/kg，推注完成后10min进行超声治疗。超声治疗时首先经尾静脉匀速推注低浓度脂氟显微泡（ 0.1ml微泡以0.3ml生理盐水稀释），推注速率为0.05ml/min，尾随0.1ml生理盐水冲管，总推注时间约9min，同时使用X4-12L高频线阵探头VFlash模式，根据分组情况调节脉冲超声参数对裸鼠皮下肿瘤进行超声辐照约10min。假照组阿霉素推注完成后仅进行超声假照，同时匀速推注0.4ml生理盐水。　　2.4. 肿瘤组织标本处理：超声治疗结束后，采用经心脏灌注法，将无菌生理盐水由左心室缓慢灌注，同时剪开右心耳，待右心耳流出清亮液体后结束灌注，取材后组织破碎、离心、取上清，用于进一步检测。　　3.观察指标　　阿霉素药物质量浓度：高效液相色谱法测肿瘤组织内药物质量浓度。　　二、诊断超声激励微泡增强乳腺癌新辅助化疗的临床初步探索　　1.分组方法　　本试验共需纳入40例乳腺癌新辅助化疗患者，根据随机数表法将受试者随机分为试验组和对照组，其中 20 例为试验组、20 例为对照组。符合入组标准的患者均采用TAC（多西他赛+吡柔比星+环磷酰胺）方案化疗1~4个不等周期。试验组患者在每次化疗药物输注结束后1h内行诊断超声激励微泡治疗，同时行超声造影以评价肿瘤血流变化情况。对照组患者在每次药物输注结束后仅进行常规超声检查，不进行超声治疗。　　2.仪器与试剂　　2.1.超声仪：VINNO 70彩色多普勒超声诊断仪（飞依诺科技有限公司，中国苏州）， X4-12L高频线阵探头。　　2.2.造影剂：声诺维(R) （注射用六氟化硫微泡）（上海博莱科信谊药业有限责任公司），微泡粒径2~4μm，浓度108/ml。　　3.超声增敏治疗方法　　首先，在治疗前对双侧乳腺及腋窝淋巴结进行常规超声扫查，记录肿瘤大小、部位及血供情况。其次，行常规超声造影检查：经肘静脉团注造影剂 5ml，尾随无菌生理盐水 3ml 冲管，固定造影切面采集肿瘤造影动态影像约 90s。造影结束后对肿瘤行超声增敏治疗。调节超声治疗参数如下：频率4MHz、脉冲重复频率20Hz、脉冲宽度18 周期、脉冲时间 0.8~1.2s、间歇时间 5s、治疗时间 900s、机械指数 0.3~0.6。选择肿瘤最大切面对肿瘤进行超声辐照，辐照开始 2min 后经静脉缓慢推注补充微泡，推注速率 0.5ml/min，推注时间 10min，推注结束后继续保持超声辐照 3min。整个超声增敏治疗共用时 15min。治疗过程中，每隔 1min 顺时针旋转探头约 60°，期间可适当调整探头方向及角度以保证肿瘤位于感兴趣区内。超声增敏治疗结束后，再次对肿瘤区域行常规超声造影，步骤与方法同前，造影切面及参数与治疗前常规超声造影保持一致。超声治疗次数与患者新辅助化疗周期数相同。　　4.观察指标　　4.1.安全性评价　　试验中密切观察有无不良事件的发生并评价，对临床出现的不良反应，随访到症状消失，并填写不良事件报告表。　　4.2.肿瘤化疗疗效评价　　在第一次新辅助化疗前和乳腺癌手术切除前，分别进行一次超声检查，测量肿瘤最大径线，参照实体肿瘤疗效评价标准(response evaluation criteria in solid tumors, RECIST)，分为完全缓解(complete response, CR)、部分缓解(partial response,PR)、稳定(stable disease, SD)及进展(progressive disease, PD)，以CR+PR统计有效率，CR+PR+SD统计疾病控制率。　　4.3.血管效应评价　　使用造影成像分析软件分别分析试验组乳腺癌病灶增敏治疗前后两次超声造影动态影像，给出时间-强度曲线，获得峰值强度（peak intensity, PI）、曲线下面积（areaunder curve, AUC）及曲线上升斜率（ascending slope,AS）等，对增敏治疗前后血流效应进行分析比较。　　结果：　　一、诊断超声激励微泡增强裸鼠乳腺癌化疗的基础研究　　A、B、C、D四组肿瘤组织内药物质量浓度分别为（0.162±0.029）μg/g、（0.170 ±0.058）μg/g、（0.186±0.045）μg/g、（0.187±0.060）μg/g，各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。　　二、诊断超声激励微泡增强乳腺癌新辅助化疗的临床初步探索　　1.本研究共纳入受试者12例，其中试验组8例，对照组4例。两组均无任何严重不良事件发生。　　2.试验组有 1 例受试者失访，2 例受试者在新辅助化疗期间更换化疗方案，故剔除。余受试者在进行了1~4个周期不等的TAC方案后行手术治疗。　　3.参照实体肿瘤疗效评价标准，对照组中 PR有3例，SD有1例；试验组中 PR有2例，SD有3例。　　4.试验组中每例受试者每次超声治疗前后时间-强度曲线分析比较（共计 11 次超声治疗），治疗前PI 52.98±11.48，治疗后PI 58.66±20.59；治疗前AS 0.68（0.40， 1.20），治疗后AS 1.34（0.65，2.74）；治疗前后PI及AS比较差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗前AUC 3741.05±803.16，治疗后AUC 4000.28±1443.09；治疗前后AUC比较差异无统计学意义（P＞0.05）。　　结论：　　1.不同声学参数（主要变化 PRF）对肿瘤局部药物浓度的影响无显著差异，说明就本实验所设参数而言，脉冲重复频率可能不是影响化疗释药的主要因素。　　2.诊断超声激励微泡能够增加临床乳腺癌肿瘤血流灌注量及灌注速度，且无明显不良反应，证实了该方法的安全性及可能的临床有效性。