病毒疗法，即利用病毒治疗肿瘤的概念最早产生于十九世纪，因为人们发现有的肿瘤患者在受到病毒感染后或注射疫苗后出现肿瘤暂时消失的现象。其后许多不同的病毒作为溶瘤制剂开始进行临床试验。最初人们只能应用病毒的粗提物，而且由于考虑不能对病毒在体内的增殖进行有效的控制，所以应用的病毒均为增殖缺陷型，但这种病毒转染率低、毒性高，所以疗效并不明显。随着病毒学、分子生物学及肿瘤学的飞速发展，人们对病毒的基因结构和功能进行了较为详细的研究，有效地对病毒基因进行改造，使改造后的病毒能够在肿瘤细胞中特异性增殖，而在正常细胞内不增殖。这样病毒一旦感染肿瘤细胞即可在肿瘤细胞内增殖并将其裂解，细胞裂解后释放的病毒颗粒再次感染其它肿瘤细胞，直到将全部肿瘤细胞杀灭。与此同时，对各种病毒的纯化和浓集方案也日益成熟，从而能够大量制备高纯度、高效价的病毒用于肿瘤治疗。目前已有近十种增殖病毒进入临床研究，其中最引人注目的肿瘤特异性增殖型病毒是美国ONYX药物公司研究的增殖型腺病毒ONYX-015，由于该病毒仅缺失了E1B55KD蛋白，所以与传统的缺夫整个E1区的腺病毒相比，它具有较强的增殖力。它利用肿瘤细胞中p53基因突变而正常细胞中p53正常的差异使病毒达到特异性增殖。由于该病毒缺失E1B55KD蛋白，所以当它感染正常细胞时，不能抑制p53基因的激活，p53被激活后，很快引起细胞凋亡，腺病毒不能再增殖，从而使感染终止。而在肿瘤细胞中p53突变或失活，因此缺失E1B的腺病毒，可以在肿瘤细胞中复制及增殖，最终导致肿瘤细胞溶解死亡，并释放新的病毒感染其它肿瘤细胞。目前该病毒已进入Ⅲ期临床试验。ONYX-015与化 第四车医大学硕1：学位论义 疗药物顺铂和5fU联合应用治疗30例难治型头颈部癌患者，其中8例完全缓 解，11例肿瘤缩小一半以上，总有效率为 63％。这是至今为止应用于临床的 最有效的生物治疗。但是，单用该病毒疗效较低，有效率cyo％，所以必须与 放化疗联合应用才能有效的杀伤肿瘤，而放化疗存在着极大的毒副作用。考虑 到同为肿瘤治疗重要手段的细胞因子治疗由于其在体内半寿期短，需要给患者 高剂量反复注射方能取得一定疗效，往往导致严重的副作用。而细胞因子基因 疗法（即将细胞因子或其受体基因通过一定技术方法导入体内，使其在体内持 续表达并发挥治疗效应），又存在着转染率低、表达量少及靶向性弱等缺点。 为此我们设想应用这种肿瘤特异性增疮型腺病毒携带某种对肿瘤治疗有明确疗 效的抗癌基因，利用病毒在肿瘤细胞内特异性增佰及复制，从而使抗癌基因在 肿瘤细胞内特异性高效表达，这种结合病毒治疗与基回治疗忧点的新型治疗方 案称为基因病毒治疗法。 为此，我们构建了 ONYX－015的类似物 CNHK－200，它与 ONYX－of 5相 比，具有携带外源基因的能力，并且将有明确抗癌疗效的细胞因子IFN－Y基 因片断插入CNHK－200，并对其抗癌作用进厅初步研究。 本头验总体可以分为以下几部分： 1．重组m！FN－Y基因肿瘤特异性增殖型腺病毒载体CNHK200－m！FN－Y的 构建及制备 门汇NHA100增殖力的检验 CNHK200结构与 ONw刁 5类似，不同之处在于该病毒具有携带外源基 因的能力。携带荧光蛋白GFP基因的该病毒称之为：CNHK200－GFP，通过荧 光显微镜观察其在正常肝细胞L02、人肝癌细胞HepGll、Hep3B中的增殖过 程，同时观察携带GFP基因的传统的腺病毒Ad－GFP，拍照进行比较。可见传 统腺病毒系统 AdGFP山于缺夫整个 EI区，而导致增殖力明显下降，在正常 肝细胞和肝癌细胞中均不增殖，而经过改造的CNHM00－GFP病毒系统仅缺 兰州车区兰州，0匹院全羊皿液俩研究中心．5． 纪叫车医人学坷！卜学位论文 失EIB55KD蛋白，因此选择性地增强了病毒在肝癌细胞中的增殖能力。本实 验正是利用CNHK－200病毒系统在肿瘤细胞中增殖力强的特点，通过基因重 组，使它携带具有抗癌能力的外源基因，以期增强病毒的抗癌能力。 （2）载体pCA13－mlry－Y及pXC－deElbmIFN－Y构建： 应用内切酶 BamHI和 EcoAI将该载体 pCA在 764hp和 1241 hp中切开， 然后回收6460hp DNA片段。将上述片断与466hp的鼠IFN－p基因连接，命 名为pCA13－mIFN－Y。将含有小鼠IFN－Y基因D 区缺失的腺病毒载体 pCAI）pIFN－Y用 Bgl 11进行酶切，得片段含有 CMV启动子＋mILl＋SV40 po卜A加尾信号、将该片段插入 pXC刁eElb载体中 Bg 11位点，应用 PCR鉴 正。 （3）CNHK200－mIFN－m病毒的重组： 将质粒 pXC＊eE比－mIFN－Y与含有 5型腺病?