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DNA疫苗在传染性疾病的防控中有重要的现实意义。但裸DNA疫苗对细胞的转染效率低,在体内难以表达抗原基因和递呈抗原蛋白。本研究针对现有DNA疫苗的等缺陷,使用穿膜肽(Cell-penetrating peptides,CPPs)与LacI蛋白前头肽突变体(LacI headpiece mutant,LacI HPM)融合表达,探讨其作为新型通用性DNA转运载体的可行性,为新型DNA疫苗载体的研究奠定了前期实验基础。穿膜肽是近年来发现的一些具有高效细胞膜穿透能力的多肽,如HIV-1 TAT,ANTP,VP22等。已经证明蛋白质和DNA等外源物质与穿膜肽融合或偶联后,可在不损伤细胞膜的情况下,快速穿过细胞膜进入胞质。并且,这种细胞内的快速运输不受细胞类型的限制。因此,与传统基因载体相比,穿膜肽体内或体外转运DNA进入细胞更具优势。本研究使用的穿膜肽分子是ANTP与TAT。ANTP是果蝇触角足蛋白(Drosphila Antennapedia)同源异型结构域中第三个α螺旋,是最早用于转运外源物质进入细胞的穿膜肽分子。TAT来源于HIV-1转录活化因子(HIV-1 Trans-activating transcriptional activator,TAT),是最早发现也是研究最多的穿膜肽分子。LacI蛋白为大肠杆菌LacI操纵子阻遏蛋白,能够与特异性识别的DNA序列(LacI Binding Sequence,LBS)高亲和力结合。LacI蛋白全长357个氨基酸,其DNA结合结构域位于LacI蛋白N端1-49个氨基酸残基区域。最近有研究证明,将位于1-62位氨基酸残基的LacI前头肽(LacI headpiece,LacI HP)突变后获得的二聚体具有与LacI蛋白相同甚至更高的特异性DNA结合能力。本研究利用PCR方法扩增获得LacI基因序列后,按文献报道,从LacI全长基因中扩增出前头肽,并将其第52位氨基酸残基由缬氨酸突变为半胱氨酸,获得LacI前头肽突变体。突变体中引入的半胱氨酸便于形成二硫键,从而形成二聚体以恢复其与DNA的结合能力。同样使用PCR方法获得ANTP和TAT片段。同时,为了提高融合蛋白对细胞的吸附能力,在ANTP和TAT与LacI HPM融合位点间添加了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(Arg-Gly-Asp,RGD)。将ANTP(-RGD)与TAT(-RGD)片段分别重组至pET-28a(+)质粒中,构建出穿膜肽(-RGD)-LacI HPM原核表达载体。此外,在TAT-LacI HPM片段C端和N端分别添加GST标签,构建了pET-28a(+)-TAT-LacI HPM-GST和pGEX-KG-TAT-LacI HPM重组表达载体。可溶性表达各穿膜肽-LacI HPM融合蛋白并纯化,在缓冲液中氧化获得了穿膜肽-LacI HPM二聚体,使用聚乙二醇(PEG)-8000浓缩后,测定二聚体蛋白溶液浓度。将二聚体融合蛋白与检测质粒体外结合后加入凝胶介质Ni-NTA或谷胱甘肽琼脂糖珠(Glutathione Sepharose 4B)中。蛋白-DNA混合物与凝胶介质结合后洗涤,收集每次洗涤后凝胶介质样品。由于检测质粒带有LacI HPM特异性结合序列,因此,通过PCR鉴定出样品中有相应的DNA片段存在,初步鉴定了二聚体融合蛋白与检测质粒DNA具有特异性和高亲和力结合活性。利用免疫荧光方法检测二聚体融合蛋白是否具有跨膜特性,将融合蛋白TAT-LacI HPM-GST和GST蛋白与细胞共同培养不同时间后,免疫荧光检测穿膜肽-LacI HPM融合蛋白跨膜效果。结果显示融合蛋白二聚体30min左右即可进入细胞,1h左右融合蛋白在细胞内浓度达到峰值,说明融合蛋白二聚体具有跨膜能力。利用增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)作为报道基因,检测穿膜肽-LacI HPM二聚体融合蛋白介导外源基因转染细胞的能力,结果表明在体外与融合蛋白结合的质粒DNA能够被介导转运进入细胞。另外,将转染后的细胞裂解,利用免疫印迹进一步证实了转染后细胞中有穿膜肽-LacI HPM融合蛋白的存在。这些结果证明了融合蛋白能够介导带有LBS的DNA表达质粒对细胞转染,并在转染细胞中表达了目的外源蛋白。本研究通过借助穿膜肽高效跨膜的特性和LacI HPM高亲结合DNA的特性,利用穿膜肽-LacI HPM融合蛋白,证明可以将带有LBS序列的DNA片段转运进入细胞,从而期望能够解决传统基因载体的不足,建立一种安全高效、无基因插入片段大小限制的基因转导系统,进而推动DNA疫苗的发展和应用。