柳蚕钙整合素结合蛋白基因的克隆与功能分析

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柳蚕Actias selene Hübner是重要的野生绢丝昆虫之一。柳蚕相对于家蚕,体型大,蛋白含量高,蚕丝耐腐蚀。目前对柳蚕的开发利用报道还很少,有待深入研究。同时,CIB蛋白在脊椎动物特别是哺乳动物中研究的较多,目前在无脊椎动物中报道的还很少。  本实验中,经 PCR扩增,克隆,测序,获得柳蚕钙整合素结合蛋白基因(Calcium and intrgrin binding protein of Actias selene Hübner, AsCIB)的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)序列,该序列全长558 bp。该序列编码185个氨基酸,预测蛋白分子量约21.26 kDa,氨基酸序列中没有信号肽。系统进化树分析以及氨基酸序列比对结果表明柳蚕 CIB基因与家蚕和大红斑蝶等鳞翅目昆虫的同源性最高,高达95%左右。后克隆目的片段与pET-28a表达载体相连接,构建出重组表达质粒pET-28a-AsCIB,并将其转化入感受态细胞BL21(DE3)中,用不同浓度的 IPTG进行小量诱导表达。经 SDS-PAGE电泳和蛋白免疫印迹Western-blot分析表明,重组蛋白成功诱导表达,分子量大小为24 kDa。经大量诱导后用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,蛋白定量免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。  以柳蚕5龄期的头、脂肪体、中肠、丝腺、马氏管、血细胞、卵巢等组织为实验材料,提取其总RNA,通过荧光定量分析柳蚕CIB基因在不同组织中的表达情况。实验结果表明柳蚕 CIB在脂肪体中表达量最高,其他组织中也均有不同程度表达。  取柳蚕的蛹,分两组,一组注射柳蚕 CIB基因的 siRNA(small interfering RNA),一组作为对照。分别取24h,48h蛹组织,提取RNA,通过荧光定量检测发现siRNA干扰CIB基因下调后明显影响相关的基因在蛹期组织中的表达,其中三个效应基因整合素α1亚基(integrinα1)、polo样蛋白激酶(polo-like-kinase1, PLK1)、蜕皮激素受体(ecdysone receptor)均呈下调趋势。  综上所述,可以得出 CIB在柳蚕各组织中广泛表达,是体内重要的蛋白分子,通过 RNAi实验我们可以推测 CIB参与了不同的信号通路,该结果将为进一步研究CIB的生理功能提供重要的参考依据。
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