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背景:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)常见而重要的并发症,病理表现主要包括肾小球硬化和肾小管间质纤维化。随着DM发病率逐年增高,DN已成为导致慢性肾衰竭的主要病因之一,然而迄今为止,其发病机制尚未充分阐明,治疗效果不佳。PTEN是一个具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的抑癌基因,可负性调控PI3K/Akt/mTOR信号通路。本课题组前期研究表明,在DN发病过程中,PTEN蛋白表达明显降低、自噬受到抑制,促进了DN肾纤维化的发生发展。但是,PTEN蛋白下调可能受多种因素影响,其调控机制尚未充分明确。研究显示,激活Notch信号通路引起PTEN下调,从而导致胃癌的发生,Hes1通过下调PTEN的表达,诱导结肠癌细胞的EMT和细胞骨架重构。提示PTEN蛋白减少可能与Notch1、Hes1的调控有关。但是在DN肾小管-间质纤维化的病变过程中,Notch1是否影响PTEN表达和自噬水平,并促进纤维化的发生发展并不清楚。有关Notch1/Hes1/PTEN信号通路调控自噬及其对DN肾小管-间质纤维化的作用机制尚未见相关研究报道。因此,有必要对此进行研究,以期进一步阐明PTEN蛋白下调、自噬抑制、纤维化病变加重的调控机制,并为糖尿病肾病肾小管-间质纤维化防治提供新的治疗靶点。目的:观察糖尿病小鼠肾组织及高糖培养的肾小管上皮细胞Notch1、PTEN表达和自噬水平的变化与肾小管-间质纤维化的关系;探讨高糖条件下肾小管上皮细胞中Notch1对PTEN表达、自噬水平及肾小管-间质纤维化病变影响的调控机制;观察糖尿病小鼠肾组织及高糖培养的肾小管上皮细胞中Hes1表达的变化并探讨肾小管上皮细胞中Notch1通过Hes1对PTEN进行调控的机制。方法:1.观察糖尿病小鼠肾组织及高糖培养的肾小管上皮细胞Notch1、PTEN表达和自噬水平的变化与肾小管-间质纤维化的关系:(1)体内实验:以db/db小鼠为研究对象,设立db/m组和db/db组,生化指标检测血糖、糖化血红蛋白、血肌酐、甘油三酯和胆固醇;通过HE、Masson染色光镜观察小鼠肾组织病理变化;免疫组织化学法检测小鼠肾组织Notch1、PTEN、LC3、Collagen-I和Collagen-III蛋白的表达和定位;western blotting检测Notch1、PTEN、p-Akt(Thr308)、Akt、p-mTOR(Ser2448)、mTOR、LC3、P62、Collagen-I和Collagen-III的蛋白表达变化;real-time PCR检测Notch1和PTEN的mRNA表达变化。(2)体外实验:以大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52e)为研究对象,分为正常糖(NG)组、高糖(HG)组和高渗(MA)组,western blotting检测Notch1、PTEN、LC3、P62、Collagen-I和Collagen-III的蛋白表达变化;正常糖(NG)组和高糖(HG)组通过real-time PCR检测Notch1和PTEN的mRNA表达变化,western blotting检测p-Akt(Thr308)、Akt、p-mTOR(Ser2448)和mTOR的蛋白表达变化。2.探讨高糖培养的肾小管上皮细胞中Notch1调控PTEN表达、自噬水平及对肾小管-间质纤维化的影响机制:采用si Notch1敲低Notch1表达,NRK-52e细胞分为以下四组:NG组、NG+si Notch1组、HG组和HG+si Notch1组,western blotting检测Notch1、PTEN、LC3、P62、Collagen-I和Collagen-III的蛋白表达变化;自噬双标腺病毒mRFP-GFP-LC3转染NRK-52e细胞16 h后,再在各组细胞中分别转染siNotch1,同时每组细胞加入100 nM的自噬诱导剂雷帕霉素,共培养48 h,DAPI染核,激光共聚焦显微镜观察自噬流变化;细胞免疫荧光化学法检测Notch1、Collagen-I和Collagen-III的蛋白表达变化。3.观察糖尿病小鼠肾组织及高糖培养的肾小管上皮细胞Hes1表达的变化并探讨肾小管上皮细胞中Notch1通过Hes1对PTEN进行调控的机制:(1)体内实验:以db/db小鼠为研究对象,设立db/m组和db/db组,western blotting和real-time PCR检测Hes1的蛋白及mRNA表达变化;免疫组织化学法检测小鼠肾组织Hes1蛋白的表达和定位;(2)体外实验:以大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52e)为研究对象,分为正常糖(NG)组、高糖(HG)组和高渗(MA)组,western blotting检测Hes1的蛋白表达变化;正常糖(NG)组和高糖(HG)组,采用real-time PCR检测Hes1的mRNA表达变化。使用Notch1过表达质粒和siHes1共转染NRK-52e细胞,正常糖条件下分为以下四组:NG组、NG+pNotch1组、NG+pNotch1+si-Ctrl组和NG+pNotch1+siHes1组;高糖条件下分为以下四组:HG组、HG+pNotch1组、HG+pNotch1+si-Ctrl组和HG+pNotch1+siHes1组,采用western blotting检测Notch1、Hes1和PTEN的蛋白表达变化;同时,细胞免疫荧光化学法检测Notch1、Hes1和PTEN的蛋白表达变化。正常糖条件下,使用p HAGE-Hes1转染细胞,分为以下两组:vector组、pHAGE-Hes1组,real-time PCR检测PTEN的mRNA表达变化,双荧光素酶报告基因检测这两组萤火虫荧光和海肾荧光的比值。结果:1.糖尿病小鼠肾组织及高糖培养的肾小管上皮细胞Notch1、PTEN表达和自噬水平的变化与肾小管-间质纤维化的关系:(1)体内实验:与db/m组比较,db/db组血糖、糖化血红蛋白、血肌酐、甘油三酯和胆固醇明显增高(P<0.01);HE染色可见db/m组肾小管结构清楚,细胞形态正常,间质无水肿,db/db组肾小管上皮细胞空泡样变性,间质中炎性细胞浸润,肾小管扩张;Masson染色显示,db/m组肾脏组织结构正常,肾小球基底膜和间质无胶原纤维堆积,与db/m组比较,db/db组肾脏组织中可见大量胶原纤维样物质沉积于肾小球毛细血管腔内和肾间质,肾小管结构排列紊乱。Western blotting结果显示,与db/m组比较,db/db组肾组织中Notch1蛋白表达明显增加(P<0.01),PTEN蛋白表达显著降低(P<0.01),p-mTOR(Ser2448)和p-Akt(Thr308)蛋白表达明显增加(P<0.01),LC3蛋白表达减少(P<0.05),P62蛋白表达显著增加(P<0.01),Collagen-I和Collagen-III的蛋白表达明显增加(P<0.01),而总的mTOR和Akt蛋白表达无明显差异;real-time PCR的结果显示,与db/m组比较,db/db组肾组织Notch1的mRNA表达增加(P<0.05),PTEN的mRNA表达降低(P<0.05);免疫组织化学检测结果可见,与db/db组比较,db/m组PTEN和LC3在肾小管间质和肾小管上皮细胞中大量表达,肾小球仅有少量表达;相反,db/m组Notch1、Collagen-I和Collagen-III在肾小管间质和肾小管上皮细胞中仅有少量表达。db/m组和db/db组中Notch1蛋白与PTEN蛋白呈显著负相关(r=﹣0.685P<0.05);(2)体外实验:NG、HG和MA条件下培养NRK-52e细胞,western blotting结果显示,与NG组比较,HG组Notch1的蛋白表达显著增加(P<0.01),PTEN蛋白表达明显降低(P<0.01),LC3蛋白表达降低(P<0.05),P62蛋白表达增加(P<0.05),Collagen-I和Collagen-III的蛋白表达显著增加(P<0.01),与NG组比较,MA组Notch1、PTEN、LC3、P62、Collagen-I和Collagen-III蛋白表达无明显差异,与NG组比较,HG组p-mTOR(Ser2448)和p-Akt(Thr308)的蛋白表达增加(P<0.01),而总的mTOR和Akt蛋白表达无明显差异;real-time PCR的结果显示,与NG组比较,HG组Notch1的mRNA表达明显增加(P<0.01),PTEN的mRNA表达降低(P<0.05)。2.高糖培养的肾小管上皮细胞中Notch1调控PTEN表达、自噬水平及对肾小管-间质纤维化病变的影响:western blotting结果显示,与NG组比较,NG+siNotch1组Notch1的蛋白表达减少(P<0.05),PTEN和LC3的蛋白表达无明显差异,P62的蛋白表达减少(P<0.05),Collagen-I的蛋白表达无明显差异,Collagen-III的蛋白表达减低(P<0.05);与NG组比较,HG组Notch1的蛋白表达增加(P<0.05)、PTEN和LC3的蛋白表达降低(P<0.05),P62、Collagen-I和Collagen-III的蛋白表达增加(P<0.05);与HG组比较,HG+siNotch1组Notch1的蛋白表达减少(P<0.05),PTEN和LC3的蛋白表达增加(P<0.05),P62的蛋白表达减少(P<0.05),Collagen-I和Collagen-III的蛋白表达减少(P<0.05)。激光共聚焦显微镜结果可见,NG+rapamycin处理条件下,转染siNotch1后,红色斑点数和黄色斑点数与对照组无明显差异,HG+rapamycin处理条件下的对照组与NG+rapamycin处理条件下的对照组比较,红色斑点数和黄色斑点数都同时减少(P<0.01),在HG+rapamycin处理条件下,转染siNotch1后,红色斑点数和黄色斑点数比对照组显著增加(P<0.01),红色斑点数和黄色斑点数基本上与NG+rapamycin处理条件下对照组的差不多;细胞免疫荧光结果显示,NG条件下,与Con组比较,NG+siNotch1组细胞Notch1、Collagen-I和Collagen-III的红色荧光强度变化不明显,蛋白表达无明显差异,与NG组比较,HG组细胞Notch1、Collagen-I和Collagen-III的红色荧光强度明显增强,蛋白表达显著增加;HG条件下,与Con组比较,HG+siNotch1组细胞Notch1、Collagen-I和Collagen-III的红色荧光强度明显减弱,蛋白表达显著减少。3.糖尿病小鼠肾组织及高糖培养的肾小管上皮细胞Hes1表达的变化并探讨肾小管上皮细胞中Notch1通过Hes1对PTEN的调控:(1)体内实验:western blotting结果显示,与db/m组比较,db/db组肾组织Hes1蛋白表达增加(P<0.05);免疫组织化学检测可见,与db/m组比较,db/db组Hes1在肾小管间质和肾小管上皮细胞核中大量表达;real-time PCR的结果显示,与db/m组比较,db/db组肾组织Hes1的mRNA表达显著增加(P<0.01);db/m组和db/db组中Notch1蛋白与Hes1蛋白呈显著正相关,(r=0.698,P<0.05);(2)体外实验:NG、HG和MA条件下培养NRK-52e细胞,western blotting结果显示,与NG组比较,HG组Hes1的蛋白表达增加(P<0.05),与NG组比较,MA组Hes1蛋白表达无明显差异;real-time PCR的结果显示,与NG组比较,HG组Hes1的mRNA表达增加(P<0.05);正常糖条件下培养NRK-52e细胞,分vector组和pHAGE-Hes1组,real-time PCR的结果显示,与vector组比较,pHAGE-Hes1组PTEN的mRNA的表达降低(P<0.05)),双荧光素酶报告基因检测两组细胞的萤火虫荧光/海肾荧光比值,与vector组比较,pHAGE-Hes1组的相对荧光素酶活性明显降低(P<0.01);Notch1过表达质粒和siHes1共转染后,western blotting结果显示,与NG组比较,HG组Notch1的蛋白表达明显增加(P<0.01),Hes1的蛋白表达增加(P<0.05),PTEN的蛋白表达减少(P<0.05),与HG+pNotch1组比较,HG+pNotch1+siHes1组Notch1的蛋白表达无明显差异,Hes1的蛋白表达减少(P<0.05),PTEN的蛋白表达增加(P<0.05);细胞免疫荧光检测结果与western blotting检测的结果一致。结论:课题组前期结果显示,糖尿病时,肾脏小管上皮细胞自噬水平下降参与肾脏间质纤维化的发生。本课题在糖尿病小鼠和高糖培养的大鼠肾小管上皮细胞中证实,高糖刺激可导致肾小管上皮细胞中Notch1表达增加,Notch1进一步通过转录因子Hes1下调PTEN蛋白的表达,导致小管上皮细胞自噬水平下降,细胞外基质蛋白合成增加,促进肾脏间质纤维化病变发生和发展。