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第一部分miR-195、miR-205在胶质瘤组织中的表达及TGF-β 1在胶质瘤患者血清中的表达及其相关性研究目的:研究miR-195、miR-205在胶质瘤组织中的表达水平以及TGF-ββ 1胶质瘤患者血清中的表达水平,并分析他们之间的关系。方法:1.实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测31例脑胶质瘤组织中的miR-195、miR-205表达水平,并检测12例非肿瘤脑组织标本作对照组。2.酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测31例胶质瘤患者血清中TGF-ββ 1表达水平,并取相同例数健康人作对照组。3.用不同浓度的TGF-β 1刺激U87细胞后,qRT-PCR检测miR-205和miR-195的表达水平。4.统计分析在胶质瘤组织样本中miR-195、miR-205与胶质瘤患者血清中TGF-β 1表达水平的相关性。结果:1.与非肿瘤脑组织相比,脑胶质瘤组织中miR-195表达显著升高。而miR-205表达则与miR-195相反,在胶质瘤组织表达比在非肿瘤脑组织明显偏低。并且二者在两种组织中表达的差异均具有统计学意义(P<0.01)。2.胶质瘤患者血浆中TGF-β1表达明显高于对照组,两组血中TGF-β 1表达的差异具有统计学意义(P<0.01)。3.我们用TGF-β1刺激U87细胞后发现,mmiR-195的表达水平随着TGF-β 1的浓度升高而上升,而miR-205的表达水平则正好相反。4.相关性分析研究表明:胶质瘤患者血浆中TGF-β 1表达水平与胶质瘤组织中miR-205的表达水平呈现负相关(R2=0.769),而与miR-195表达水平呈正相关(R2=0.794)。结论:miR-195在人脑胶质瘤组织中以及TGF-β 1胶质瘤患者血清中表达均上调,而miR-205表达则下调,胶质瘤组织中miRNA-195表达水平与其血清TGF-β 1的浓度呈正相关,而miRNA-205表达水平与TGF-β 1的浓度呈负相关,并且呈浓度依赖关系。第二部分miR-205、miR-195及TGF-β1对胶质瘤细胞U87增殖和侵袭活性影响的研究目的:研究过表达miR-205、miR-195及TGF-β 1对U87细胞的生物学活性的影响。方法:1.对 U87 分别细胞转染 miR-205 mimic、miR-205 inhibitor 以及 miR-195 mimic、miR-195 inhibitor后,采用细胞克隆形成实验、MTT实验、Transwell实验检测U87细胞的增殖、侵袭能力的变化。2.用TGF-β 1、TGF-β 1抑制剂LY364947分别处理细胞后,采用细胞克隆形成实验、MTT实验、Transwell实验检测U87细胞的增殖、侵袭能力的变化。结果:1.细胞克隆形成实验结果:与对照组比较,miR-205mimics转染组U87细胞的克隆形成数量明显减少,miR-195mimics转染组U87细胞的克隆形成数量明显增多,而miR-205 inhibitor转染组U87细胞的克隆形成数明显增多,miR-195 inhibitor转染组U87细胞的克隆形成数量明显减少。TGF-β 1刺激U87细胞后形成克隆数量明显增多,而TGF-β 1抑制剂组则形成克隆数量明显减少。(P<0.05)2.MTT实验结果显示,对比对照组,miR-205mimics转染组U87细胞的增殖率显著降低,miR-195 mimics转染组U87细胞的增殖率明显增高,而miR-205 inhibitor转染组U87细胞的增殖率明显增高,miR-195 inhibitor转染组U87细胞的增殖率明显降低。TGF-ββ 1刺激U87细胞组细胞增殖率显著升高,而TGF-ββ 1抑制剂组与对照组相比则细胞增殖率显著降低。(P<0.05)3.Transwell实验结果显示,miR-205 mimics和miR-195 inhibitor转染组穿过小室基底膜的紫色细胞数量明显少于阴性对照组,而miR-195 mimics和miR-205 inhibitor转染组穿过小室基底膜的紫色细胞数量明显多于阴性对照组。TGF-β 1刺激U87细胞组穿过小室基底膜的细胞数量也明显多于阴性对照组,而TGF-ββ 1抑制剂组与对照组相比则穿过小室基底膜的细胞数量明显减少。(P<0.05)结论:1.miR-195及TGF-β 1过表达可增强U87细胞的克隆形成、增殖及侵袭能力。2.miR-205过表达可抑制U87细胞的克隆形成、增殖及侵袭能力。第三部分miR-205、miR-195与TGF-β 1信号分子SMADs在胶质瘤中相互作用机制的研究目的:研究胶质瘤中miR-195、miR-205与TGF-β 1信号分子SMADs的相互作用机制。方法:1.利用Western blot实验检测miR-205/195过表达或者抑制情况下U87细胞中SMADs的表达情况,并用双荧光素酶活性(Luciferase)实验进一步验证SMADs的表达情况。2.利用免疫共沉淀(Co-IP)方法检测了在miR-205/195过表达或者抑制情况下,不同SMADs蛋白之间的相互作用情况。结果:1.Western blot检测结果:与对照组比较,miR-205 mimic转染组SMAD2表达水平明显降低,miR-205inhibitor转染组SMAD2表达水平明显升高,SMAD3,SMAD4和SMAD7表达水平均无明显变化。miR-195 mimic转染组Smad7蛋白的表达水平明显降低,p-SMAD2、p-SMAD3表达水平明显升高,miR195 inhibitor转染组SMAD7表达水平明显升高,p-SMAD2、p-SMAD3的表达水平明显降低,t-SMAD2、t-SMAD3和SMAD4的表达水平无明显变化。2.双荧光素酶活性(Luciferase)实验结果:miR-205 mimics转染后,SMAD2-3’UTR荧光素酶活性明显降低,miR-205 inhibitor转染后,SMAD2-3’UTR荧光素酶活性明显增强,SMAD3,SMAD4以及SMAD7-3’ UTR荧光素酶活性没有明显变化。miR-195 mimics转染后SMAD7-3’UTR的荧光素酶活性明显降低,miR-195 inhibitor转染后,SMAD7-3’UTR荧光素酶活性明显增强,SMAD2、SMAD3和SMAD4-3’ UTR荧光素酶活性没有明显变化。3.免疫共沉淀(CO-IP)实验结果:对比对照组,miR-205 mimic转染免疫沉淀组SMAD2表达水平明显降低,miR-205 inhibitor转染免疫沉淀组SMAD2表达水平明显升高。miR-195 mimic转染免疫沉淀组SMAD2蛋白的表达水平明显升高,miR195 inhibitor转染免疫沉淀组SMAD2表达水平明显降低。结论:1.SMAD2和SMAD7分别是miR-205和miR-195的靶向基因。2.miR-205可抑制SMAD2的表达;miR-195可抑制SMAD7的表达,同时具有促进p-SMAD2、p-SMAD3表达的作用。3.miR-205可显著抑制SMAD2/SMAD4异聚体的形成,miR-195则能促进SMAD2/SMAD4异聚体的形成。