分子伴侣蛋白普遍存在于原核和真核细胞中，其主要功能是防止新生及组装过程中的肽链错误折叠，形成无活性的结构。Spy（Spheroplast Protein Y）是近年来发现的一种新型分子伴侣蛋白，它具有分子量小，且不依靠辅因子（辅助分子伴侣蛋白、ATP）就可发挥分子伴侣活性的特点。目前对Spy所进行的研究工作中，还未确定Spy生理底物谱，因此目前还无法解释Spy与其底物的作用机理。本课题拟在通过体内交联法串联质谱以及蛋白质差异表达法串联质谱两种方法找到Spy的生理底物，从而更加深入的探索Spy与底物的作用机制。结合这两种方法我们得到了一份复杂的分子伴侣蛋白Spy可能的生理底物表。这些底物蛋白中包括了14个周质蛋白，5个内膜蛋白，5个外膜蛋白及3个菌毛蛋白。这些蛋白与细菌对宿主细胞的侵染以及细菌耐药性等过程密不可分。随后，我们利用蛋白质体内片段互补技术（Protein Complementary Assay-PCA）验证了表中部分蛋白与Spy在体内相互作用。在Spy与其可能底物体内相互作用验证实验中我们观察到，即使在不加丁醇变性剂的条件下，依旧能观察到周质蛋白PstS及外膜蛋白OmpX与Spy有明显相互作用;而外膜蛋白OmpC及OmpW则只能在加入丁醇变性剂的条件下观察到与Spy有微弱的相互作用。在后续实验中我们将对找到的与Spy在体内有相互作用的蛋白质进行体外相互作用验证。当找到Spy真实的生理底物蛋白之后，通过对Spy及其底物作用机制的研究，可以为我们提供大量的分子伴侣是如何与其底物相作用的细节信息。　　Spy主要作用区域为细菌周质空间，在革兰氏阴性菌中，细菌外膜与内膜之间存在一层薄腔，称之为周质，这层空间处于氧化环境，无ATP分子，对外界环境敏感，并且存在着大量的周质蛋白，而目前我们对这些周质蛋白间体内相互作用了解甚少。本课题中我们对检测胞质中蛋白质相互作用的蛋白质体内片段互补技术（Protein Complementary Assay-PCA）进行了改造，并成功利用该系统检测到了细菌周质蛋白间的相互作用。周质蛋白FimFt（FimF蛋白敲除N端12个氨基酸残基）及FimC已得到体内复合物晶体结构，而我们也成功运用了改造后的蛋白质体内片段互补技术验证了二者之间具有相互作用。该系统成熟的应用，无疑为我们今后研究周质蛋白之间的相互作用提供了一种可靠的体内相互作用验证手段。