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目的：
探讨MIP1-α对肠上皮细胞屏障的通透性及紧密连接蛋白分布及表达的影响
材料与方法：
1、肠屏障体外模型的建立:应用人大肠腺癌细胞株(Caco-2细胞)为陈誉华教授惠赠。将1×105加到孔径为0.4微米的Transwell(Costar)24孔板上,定时换液,培养4天后细胞达到融合状态,形成具有紧密连接的上皮细胞单层。
2、单层细胞通透性分析:在Transwell上室中加入浓度为50ng/ml MIP1-α,分别孵育0、1、4、8、16h;加入不同浓度的MIP1-α(0、5、10、50 ng/ml)孵育8h,观察加入MIP-1α前后MIP-1α对Caco-2细胞辣根过氧化物酶透过率的影响。
3、用免疫荧光法观察MIP1-α与Caco-2细胞相互作用后肠上皮细胞紧密连接蛋白Zo-1和Occudin的变化。
3.1在盖玻片上接种Caco-2细胞,培养至完全融合时加入MIP1-α,37℃孵育0、2、4、8、16、24小时,用免疫荧光染色检测ZO-1的变化。
3.2在盖玻片上接种Caco-2细胞,培养至完全融合时加入MIP1-α,37℃孵育0、2、4、8、16、24小时,用免疫荧光染色检测Occudin的变化。
结果：
1、 MIP-1α增加肠上皮细胞屏障的通透性与对照组相比,在MIP-1α作用8小时后,过氧化物酶的通透性开始升高,16小时这种作用达到最强。
2、 MIP-1α引起肠上皮细胞紧密连接蛋白Zo-1和occludin的定位异常。正常Caco-2细胞,occludin及Zo-1蛋白沿细胞膜分布;加入MIP-1α50ng/ml作用2小时后,Zo-1及occludin蛋白呈锯齿状分布,并且荧光信号减弱;加入MIP-1α50ng/ml作用24小时后,锯齿状分布更加明显,荧光信号进一步减弱,并且在胞浆内可见阳性染色。
结论：
1、MIP-1α增加肠上皮细胞屏障的通透性
2、MIP-1α引起紧密连接蛋白Zo-1及occludin的异常分布及表达减弱。