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铜是动物体必需的微量元素之一，广泛分布于体内的组织和器官。现已证实，铜以多种酶的形式参与机体氧化磷酸化、自由基解毒、色素合成、儿茶酚胺代谢、结缔组织交联、血液凝固和毛发形成的代谢过程。铜能调节机体神经内分泌激素的分泌，增强动物体各种激素的释放。 铜被吸收进入机体后，在各组织和器官的分布是不均匀的，其中肝、肾、心、眼及毛发中铜含量极高，其次是胰腺、皮肤、肌肉、脾脏及骨组织，而脑垂体、胸腺、甲状腺、前列腺及卵巢和翠丸均为含铜量低的器官组织。 动物长期饲喂高铜日粮会导致铜在肝脏和其他组织器官中大量蓄积，引起肝细胞坏死、贫血、高铜症、胆红素血症，最终因铜中毒而死亡。苏晓鸥试验证实，长期饲喂高铜日粮的猪，肝脏中有大量铜蓄积，多种酶活性受到抑制。钱莘莘也报道肝铜残留量与饲料中铜量呈线性关系。崔恒敏研究报道，雏鸭铜中毒时，肝细胞肿大，颗粒变性和空泡变性，电镜下观察到糖原颗粒减少，胞浆和胞核内出现大小不等、电子密度极高的团块状或颗粒状沉积物。 近几年来，不少学者对铜在动物体内的相关代谢进行了研究，但目前为止对铜导致的机体氧化损伤机理的研究还不够深入。本课题拟建立实验动物肉鸡肝脏细胞铜负载下的体外模型，通过测定各种细胞层面的氧化损伤指标来讨论不同剂量的铜对肉鸡肝脏氧化损伤的影响。 本试验在体外细胞培养试验中，选用无水硫酸铜作为实验铜源，应用改良的半原位灌流法从成年科宝商品代肉鸡肝脏中分离肝细胞，参考E.A.Roberts(2004)，Jason M.Hansen(2005)和Mirella Vazzana(2009)的对铜离子作用的研究，设立正常对照组，含铜组(10μm/ml，50μm/ml和100μm/ml)以及阳性对照组(含高浓度抗氧化剂)。阳性对照组通过MTT活性测定，计算出半抑制浓度IC50=50。5um/ml，即阳性对照组由50μm/ml Cu2++50μm/ml抗氧化剂Vc构成(保护Cu2+不被氧化为Cu1+从而限制铜进入细胞和延缓细胞过氧化损伤)。各浓度组分别于48h选取不同的铜孵育取样进行相关实验，并且每个铜孵育时间重复三次各浓度组的相关实验，每次各重复取样两个，即共六个样品重复量。 为了阐明无机铜离子对成年肉鸡原代肝细胞凋亡的影响，本实验分为两个部分，具体内容和结果如下： 1、体外培养的成年肉鸡原代肝细胞对铜的摄入试验表明，体外培养的成年肉鸡原代肝细胞对铜的摄入量每组均超过了75％，表明铜离子进入了体外培养的肝细胞并产生了作用。从而为研究铜调控机制提供重要理论基础。 2、铜离子对成年肉鸡原代肝细胞凋亡的影响 (1)铜离子对体外原代培养的肝细胞细胞周期有较明显的影响，当肝细胞处于对数增长期时，铜离子对细胞增殖具有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性。10μm/ml组和50μm/ml组对细胞增殖抑制作用不明显(P>0.05)；100μm/ml组的G0/G1期细胞比例明显增加(P<0.05)，S期和G2+M期比例降低(P<0.05)；Vc对铜离子孵育的细胞具有保护作用，能减轻铜离子对细胞增殖的抑制作用，与100μm/ml组相比，50μm/ml Cu2++50μm/ml组的G0/G1期细胞比例明显减少(P<0.05)，S期和G2+M期比例增加(P<0.05)。表明铜含量达到100μm/ml及以上时，肝细胞由静止期进入S期受阻，提示铜干扰了细胞周期的正常信号传导，使肝细胞由静止期进入增殖期的数量增多，铜对肝细胞细胞周期影响的机理可能与核酸代谢异常有关。 (2)实验中，细胞膜电位随着铜离子浓度的增加，激光共聚焦显微镜所测肝细胞荧光强度渐弱，表明细胞通透性增加，细胞膜电位下降。与对照组相比，10μm/ml组膜电位下降不明显(P>0.05)，50μm/ml组和100μm/ml组膜电位明显下降(P<0.05)；与Cu2+浓度为50μm/ml时相比，50μm/ml Vc+50μm/ml Cu2+组能够明显增强荧光强度，抑制细胞膜电位下降(P<0.05)，表明Vc能够减轻Cu2+对细胞的损伤，对细胞具有一定的保护作用。 (3)铜离子对体外原代培养的肝细胞细胞内游离钙有较明显的影响。Fluo-3-Am为一新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，可以灵敏地反映细胞内游离钙离子浓度的变化。随着铜离子浓度的增加，流式细胞仪所测荧光强度逐渐增强，表明细胞内游离钙的浓度逐渐增加，与对照组相比，10μm/ml组游离钙浓度上升明显(P<0.05)，50μm/ml组和100μm/ml组游离钙浓度差异不显著(p>0.05)；与Cu2+浓度为50μm/ml时相比，50μm/mlVc+50μm/ml Cu2+能够降低荧光强度，抑制细胞内钙离子上升(P>0.05)，表明Vc能够减轻Cu2+对细胞的损伤，对细胞具有一定的保护作用。 (4)DNA断裂是细胞凋亡的最晚期生化特征。正常活细胞DNA基因组条带由于分子质量大，迁移距离短，所以停留在加样孔附近。坏死细胞由于其DNA的不规则降解显现一条连续的膜状条带；而只有发生凋亡的细胞才会出现梯状条带。0μm/ml，10μm/ml组均未见到明显的变化，随着铜含量的增加，逐渐出现明显的梯度裂解的特征。