视网膜缺血再灌注损伤(RIRI)是一种眼科非常常见的病理过程,与多种疾病有关,可以导致视网膜神经节细胞(RGCs)变性死亡、视网膜结构紊乱和功能下降,最终导致不可逆的视力损伤,预后较差。RIRI的发病机制非常复杂,目前尚未完全阐明,大量的研究表明RIRI与多种因素综合作用有关,包括氧自由基生成、细胞内钙离子超载、微血管损伤、微循环障碍等。另外,炎症因子介导的免疫炎性反应及白细胞浸润也备受关注。RIR损伤与炎症因子之间有着密切的关系,在RIR损伤的亚急性期,炎症相关基因被激活,可以诱导多种炎性细胞因子生成,如TNF-α、IL-1、IL-6等,同时有大量的细胞因子可以起到保护作用。白细胞介素-33(IL-33)是Schmitz等在2005年新发现的一个多功能细胞因子,可以通过与其特异性受体ST2结合,参与调节机体的炎症反应、感染性疾病、变态性疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病及肿瘤等多种疾病的发生发展过程。IL-33/ST2信号途径在炎症反应中起着重要的调节作用,可激活下游的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及核因子-κB(NF-κB)等信号通路,引起机体一系列炎性反应。也有研究表明,IL-33是一把“双刃剑”,在不同的疾病类型及不同的免疫环境中,IL-33发挥的作用大相径庭,既可能是促炎作用又有可能是保护作用。目前已证实,IL-33在多种组织与器官的缺血再灌注损伤中扮演着保护因子的角色,发生机制可能与促进Thl/Th2平衡向Th2偏移、抑制IL-1β、TNF-α等炎性因子释放、抑制细胞凋亡等有关。但IL-33在RIRI中的表达变化及作用目前尚未见相关研究。近些年来随着对视网膜缺血性疾病的研究日益广泛和深入,人们发现炎症和细胞凋亡与RIRI的关系极为密切。在RIRI中,炎症介质的释放和白细胞浸润放大了其炎性损伤,IL-1β、TNF-α是最重要的促炎因子。细胞凋亡是视网膜再灌注后损伤的主要形式之一,可以导致持续的组织损伤及功能丧失,尤其是RGCs。凋亡是一种受到多种基因表达和蛋白调控的特殊的细胞死亡过程。Bcl蛋白家族在细胞凋亡过程中具有重要的调节作用,其中Bcl-2是最重要的抗凋亡蛋白,而Bax蛋白则具有促凋亡的作用。NF-κB是一个多功能核转录因子,激活可导致相关炎症因子的表达上升,并且与细胞凋亡的关系密切。有研究显示NF-κB的激活可能介导RGCs的凋亡,其与RIRI也有着密切的关系。基质金属蛋白酶9(MMP-9)可以降解细胞外基质,破坏血-视网膜屏障,促进视网膜水肿的发生,同样参与了 RIRI后的炎性反应。已有大量研究证实,在RIRI中,通过干扰炎症反应及凋亡通路可以达到保护缺血性视网膜神经细胞的目的。因此,本研究通过建立大鼠RIRI模型,探讨大鼠RIRI过程中IL-33的动态表达与分布,初步揭示IL-33在RIRI中可能存在的意义,但是其发挥促炎作用还是抑炎作用尚不清楚。在缺血前1h采取玻璃体腔内注射外源性的重组IL-33进行预处理的方法,观察外源性IL-33对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的影响。通过对视网膜功能、组织病理、炎性因子及凋亡蛋白的观察,对IL-33缓解大鼠视网膜缺血再灌注损伤的可能机制进行初步探讨,为治疗视网膜缺血再灌注损伤提供新的理论依据。本课题包括以下三个部分:第一部分大鼠视网膜缺血再灌注损伤中IL-33的动态表达及意义目的通过建立SD大鼠RIRI模型,检测大鼠视网膜组织中IL-33的动态表达及定位,探讨IL-33在RIRI中的可能作用。方法将60只SD大鼠利用随机数字法随机分为正常对照组(NCG)和模型组(MG),RIRI模型采用前房灌注生理盐水升高眼内压的方法,其中MG组再按缺血再灌注后不同时间点分为6h、12h、24h、72h、144h组,每组10只大鼠。行苏木精-伊红(H-E)染色观察各时间点视网膜的组织结构;免疫组织化学方法检测不同时间点IL-33蛋白在视网膜上的动态表达及定位;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各时间点视网膜组织中IL-33以及IL-1β、TNF-α的表达水平和变化规律,并分析几种细胞因子之间的相关性。结果成功建立了 RIRI模型。HE染色可见NCG组视网膜各层结构与层次清楚,排列整齐,极少数炎性细胞浸润,MG组不同时间点的视网膜组织均出现不同程度的组织水肿,细胞排列疏松,结构较为紊乱,神经纤维层及内丛状层尤其明显,并伴有较多炎性细胞浸润聚集;免疫组织化学染色显示IL-33在NCG组视网膜即有低度表达,MG组中的表达明显增强,主要表达于视网膜神经节细胞层和内核层,在细胞核和细胞浆中均有表达;ELISA结果显示6h、12h、24h、72h、144h视网膜组织中IL-33的表达水平较NCG组均明显升高,差异具有显著统计学意义(P<0.01),24h达高峰,同时IL-33表达的变化水平与IL-1β、TNF-α的表达水平呈正相关(r=0.845、0.895,P=0.034、0.016)。结论IL-33在大鼠RIRI视网膜组织中的表达明显增强,并且与促炎因子IL-1β、TNF-α有着近似的变化规律,提示IL-33有可能在视网膜缺血再灌注损伤后的炎症反应中起着重要的作用。第二部分IL-33预处理对大鼠视网膜缺血再灌注损伤后视网膜功能和结构的影响目的观察IL-33预处理对大鼠视网膜缺血再灌注损伤后视网膜功能和结构的影响。方法采用随机数字法将60只SD大鼠随机分为4组,每组15只:(1)正常对照组(NCG组);(2)单纯缺血再灌注组(MG组);(3)IL-33预处理组(IL-33组):于造模前1h使用微量注射器玻璃体腔内注射重组IL-33 2μg(5μl);(4)PBS对照组(PBS组):于造模前1h玻璃体腔内注入等量的PBS溶液(5μl)。每只大鼠取右眼进行造模,再灌注24h后行以下检测:(1)视网膜电图(ERG)检测;(2)HE病理切片染色光镜下观察各组视网膜组织结构变化、炎性细胞浸润情况、视网膜各层厚度及视网膜神经节细胞数量等;(3)核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口标记(Tunel)法检测视网膜各层细胞凋亡情况。结果ERG结果显示,与NCG组相比,MG组b波振幅明显降低(t=5.765,P=0.000),说明缺血再灌注可以明显损伤视网膜内层细胞的生理功能,而IL-33组b波振幅显著高于MG组及PBS组(t=2.420、3.024,P=0.022、0.005),且b波比值与MG组及PBS组比较差异也有统计学意义(t=9.144、9.597,P=0.000、0.000)。通过HE染色可发现,IL-33组视网膜水肿较MG组及PBS组减轻,细胞排列也较为整齐,少许炎性细胞浸润,与MG及PBS组相比差异有统计学意义(t=3.697、4.715,P=0.0017、0.0002),视网膜神经节细胞计数与MG及PBS组相比差异有统计学意义(t=2.807、3.188,P=0.012、0.005)。Tunel法证实:IL-33预处理组中,凋亡细胞呈低度阳性表达,凋亡指数与MG组及PBS组比较明显降低,差异有统计学意义(t=4.560、5.225,P=0.0002、0.0001)。结论IL-33预处理对大鼠视网膜缺血再灌注损伤后视网膜的功能及组织结构均具有保护作用,并抑制炎性细胞浸润及视网膜细胞凋亡。第三部分IL-33预处理对大鼠视网膜缺血再灌注损伤作用机制的初步探讨目的初步探讨IL-33预处理在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中对视网膜起保护作用的可能机制,为RIR损伤提供新的临床治疗方法及理论基础。方法采用随机数字法将100只SD大鼠随机分为4组,每组25只:(1)正常对照组(NCG组);(2)单纯缺血再灌注组(MG组);(3)IL-33预处理组(IL-33组):于造模前1h使用微量注射器玻璃体腔内注射重组IL-33 2μg(5μ1);(4)PBS对照组(PBS组):于造模前1h玻璃体腔内注入等量的PBS溶液(5μl)。再灌注24h后行:(1)免疫组织化学方法检测视网膜组织Bcl-2及Bax表达变化;(2)Western-blot检测视网膜组织中Bcl-2、Bax及NF-κB活化 P65(p-P65)的表达;(3)Real-time PCR 检测了 Bcl-2、Bax 及 MMP-9 的mRNA的表达;(4)提取视网膜组织,ELISA检测IL-1β、TNF-α的表达变化;(5)采用明胶酶谱法检测MMP-9的活性。结果免疫组织化学方法证实IL-33预处理后,Bcl-2表达水平均高于MG组和PBS组(t=2.334、2.388,P=0.0479、0.0440),而Bax的表达水平明显低于 MG 组和 PBS 组(t=4.794、5.190,P=0.0014、0.0008)。Western blot 显示 IL-33预处理后,Bcl-2的表达水平较MG组及PBS组升高(t=3.339、2.686,P=0.0102、0.0277),而 Bax 表达水平较型组及 PBS 组降低(t=4.010、4.406,P=0.0039、0.0023),同时发现IL-33组NF-κB p65的表达水平低于MG组及PBS组(t=3.404、3.721,P=0.0093、0.0059)。Real-time PCR 提示,IL-33 组 Bax mRNA 的表达低于 MG 及 PBS 组(t=5.911、5.793,P=0.0004、0.0004),而 Bcl-2 mRNA 的表达高于 MG 及 PBS 组(t=9.195、9.887,P=0.000、0.000),同时 IL-33 组 MMP-9 mRNA 的表达水平较 MG 组及 PBS 组下降(t=5.175、6.152,P=0.0008、0.0003)。明胶酶谱法显示IL-33组MMP-9的活性较MG及PBS组明显降低(t=5.781、7.023,P=0.0004、0.0001)。ELISA 检测 IL-33 组中 IL-1β、TNF-α的含量较 MG组明显降低(t=10.349、7.200,P=0.000、0.0001)。结论IL-33预处理可以提高视网膜组织中Bcl-2的表达,抑制Bax的表达,阻止视网膜细胞凋亡;抑制NF-κB p65活化,抑制TNF-α,IL-1β等炎性因子的释放,并降低MMP-9的表达和活性。这些结果表明,IL-33可以通过减轻炎症反应和抑制细胞凋亡来减轻视网膜缺血再灌注损伤。本课题第一部分通过建立SD大鼠RIRI模型,首次观察了 IL-33这一新发现的多功能细胞因子在大鼠RIRI中的动态表达变化,结果提示IL-33在RIRI中表达增强,24h达高峰,并与促炎因子IL-1β、TNF-α具有近似的变化规律,提示IL-33有可能在视网膜缺血再灌注损伤后的炎症反应中起着重要的作用,参与了RIRI的病理损伤过程。IL-33是一种“预警分子”,在机体受到炎性因子和物理化学因素的刺激时,能由受损或坏死的上皮及内皮细胞分泌到细胞外。但IL-33在RIRI病理过程中究竟起着促炎还是抑炎的作用尚未明了,因此本课题第二部分采取玻璃体腔内注射外源性的重组IL-33的方法,在建模前对SD大鼠进行预处理,结果显示IL-33可以保护RIR损伤后视网膜的功能及组织结构,抑制炎性细胞浸润,减少视网膜细胞的凋亡。第三部分进一步初步探索其可能机制,发现IL-33预处理后,可以减少炎性因子释放,并调节相关凋亡蛋白的表达,降低视网膜神经元细胞的凋亡。因此,IL-33在大鼠RIRI模型中,很有可能是一种抑炎因子及抑制凋亡的因子,与促炎因子共同释放参与了 RIRI的发生发展过程,并且与促炎因子之间存在一个动态的相互平衡的关系。但IL-33及IL-33/ST2在视网膜缺血再灌注损伤中的具体传导通路有待进一步研究。