细胞程序性死亡（Programmed cell death, PCD）是一类由生物体控制的有序的死亡现象，对生物体正常的生长发育及其抵抗各类生物和（或）非生物性胁迫具有重要意义[1]。在植物中，已分析鉴定出了一系列和动物细胞PCD调控蛋白具有相似结构、功能的蛋白质，但对某些关键蛋白酶如caspase知之甚少，尚未建立起比较完整的基因调控网络通路[2-5]。　　液泡加工酶(Vacuolar processing enzyme，VPE)是一类半胖氨酸蛋白酶，属于蛋白酶C13家族。液泡加工酶在种子储存蛋白加工成熟、种皮形成、细胞程序性死亡过程中发挥着关键作用。本实验室前期研究表明在非生物胁迫中，抗凋亡基因Bcl-2可以显著抑制水稻OsVPE2和OsVPE3基因的转录水平上调，从而抑制PCD的发生和提高水稻的胁迫耐受性。因此，我们期望通过构建OsVPE3的水稻转基因株系，进一步研究OsVPE在非生物胁迫中的作用。　　蛋白质之间的相互作用，对于维持蛋白质的结构和发挥生物功能具有重要意义。本研究在水稻原生质体瞬时表达系统中，利用免疫共沉淀和Pull-down技术，探索了抗凋亡基因Bcl-2潜在的互作蛋白。　　目前取得了如下成果:　　1.OsVPE3表达载体的构建和转基因水稻的获得　　构建了OsVPE3（Os02g0644000）基因相应的启动子、干涉、过表达载体，利用农杆菌侵染介导法转化成熟胚诱导愈伤组织，潮霉素筛选得到了抗性幼苗。　　2.OsVPE3各株系筛选和表达量分析　　对抗性幼苗进行潮霉素筛选、繁育，筛选得到VPE3两个T3代过表达纯系（命名为M3-7-1和M3-8-7）和一个T3代干涉纯系（命名为M7-9-1）。　　对上述株系进行了实时定量PCR鉴定。实验结果显示，与野生型相比，OsVPE3过表达株系M3-7-1和M3-8-7中，OsVPE3 mRNA水平分别上升到1006倍和577倍;而在干涉株系M7-9-1中，其表达水平下调到0.24倍。　　OsVPE3基因的启动子分析转基因材料目前处于T1代，在DNA水平上鉴定出了5个独立阳性株系。　　3.OsVPE3蛋白的亚细胞定位分析　　构建了OsVPE3-GFP融合蛋白的pUGW5-VPE3瞬时表达载体，进行水稻原生质体转化，并利用共聚焦荧光显微镜观察OsVPE3-GFP融合蛋白的亚细胞定位。结果表明，OsVPE3融合蛋白的绿色荧光分布于液泡中，同时在细胞其他部分（如胞质）也存在着荧光信号。这揭示了OsVPE3蛋白最终定位于中央液泡，其他细胞部分存在荧光信号可能是由于OsVPE3融合蛋白仍处于修饰、转运过程。　　4.水稻中Bcl-2相互作用蛋白的探究　　构建了若干植物瞬时表达载体如pUGW11-Bcl2（实验组载体）和pUGW11-GFP（对照组载体），并优化了原生质体制备培养条件，成功在原生质体中积累表达相应的融合蛋白。　　结合免疫共沉淀和Pull-down技术，利用anti-FLAG beads成功分离纯化了Bcl2-FLAG和GFP-FLAG融合蛋白及其可能的互作蛋白。通过SDS-PAGE胶银染、免疫杂交、高效液相串联质谱验证分析了洗脱混合物中的蛋白样品;构建了潜在互作蛋白Os01t0348900、Os05t0536200、Os02t0802500表达载体。