蛋白质修饰位点是影响聚乙二醇化蛋白结构与生物学活性的关键性因素之一，筛选合适的分析方法对蛋白质的修饰位点进行识别是修饰蛋白质质量控制的关键。论文以重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）和溶菌酶（Lysozyme）为模型蛋白，采用单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯（mPEG-SC5k）分别对其进行了修饰，利用生物质谱等技术研究了修饰蛋白质表面PEG偶联位点的识别方法，主要结论如下：（1）研究了基于胰蛋白酶降解结合质谱分析的PEG偶联位点识别方法。结果表明胰蛋白酶内切法结合质谱分析技术可识别rhG-CSF表面上PEG的偶联位点，以及不同修饰位点的比例，在实验采用的修饰条件下，与PEG偶联的多肽序列为T1PLGPASSLPQSFLLK16，偶联位点发生在T1和K16，修饰比例为96.4:3.6。该识别方法无需繁琐的样品预处理过程且适合于多位点识别，PEG对酶解程度存在一定影响，酶解条件需要优化。在HPLC-MS分析过程中多肽分离度是影响离子化效率以及定量分析结果的重要因素。（2）探索了基于复合酶解-质谱分析的PEG偶联位点识别方法。依次采用胰蛋白酶和糜蛋白酶对PEG-rhG-CSF进行了酶解并对酶解产物进行质谱分析，结果表明胰蛋白酶降解程度对识别结果的影响不显著且该方法同样适于多位点分析，与PEG偶联的多肽序列为T1PLGPASSLPQSFLLK16，PEG偶联在rhG-CSF上的位点为T1和K16，修饰比例约为96:4；但该识别方法需要分离出胰蛋白酶降解物中全部偶联PEG的多肽，糜蛋白酶的特异性降解位点种类较多，导致降解后的部分多肽序列过短而不利于HPLC-MS分析，该方法受目标蛋白的氨基酸序列影响显著。（3）考察了基于色谱法PEG化多肽分离以及多肽氨基酸组成分析的PEG修饰位点识别方法。采用反相色谱从PEG-rhG-CSF的酶解产物中分离出偶联PEG的多肽，用柱前衍生法对其进行氨基酸组成分析，结果表明PEG偶联多肽的氨基酸组成与T1PLGPASSLPQSFLLK16的多肽序列对应，PEG偶联在rhG-CSF上的位点为T1和K16，修饰比例约为95:5。该方法以氨基酸组成分析为基础，但用于定量分析不同修饰位点时对多肽的色谱分离有特殊要求。（4）研究了基于Edman降解法的PEG偶联位点识别方法。收集聚乙二醇化蛋白质胰蛋白酶酶解产物中偶联PEG的多肽，通过Edman降解法从N末端按照序列顺序依次切割并确定氨基酸种类，结果表明与PEG偶联多肽的序列包含PLGPASSLPQSFLLK，偶联位点发生在T1和K16，修饰比例约为95:5。该方法中多肽纯度是影响识别结果的关键因素。在实际样品分析中由于不同蛋白质的氨基酸序列存在差异，蛋白质上修饰位点存在不均一性。识别PEG修饰蛋白的修饰位点以及不同修饰位点的比例可采用多种分析方法相结合的方式，本研究结果表明在进行定性分析时，氨基酸组成分析法和Edman降解法具有分析快速等优点，而在进行定量分析时，胰蛋白酶解法以及糜蛋白酶解法是识别修饰蛋白PEG偶联位点的良好方法且适于多修饰位点识别。