论文部分内容阅读
去泛素化酶(deubiquitinases,DUBs)是通过水解底物蛋白泛素链之间的链接,对蛋白降解进行反向调节,从而影响或者调节细胞的代谢、分化、增殖等。近年来研究发现,去泛素化酶表达异常或功能改变与肿瘤的发生、发展密切相关。b-AP15是一种新型的抑制蛋白酶体19S调节亚基相关去泛素化酶活性的小分子抑制剂,在多发性骨髓瘤、结肠癌以及急性髓细胞样白血病模型中显示出良好的抗肿瘤活性。有研究表明b-AP15的靶向底物UCH37在食管癌组织中高表达,并与食管癌的TNM分期、淋巴结转移显著正相关,提示b-AP15可能成为靶向治疗食管癌的候选药物。但是b-AP15在食管癌中的抗肿瘤效果及杀伤肿瘤细胞的分子机制目前尚未有研究。因此通过体外实验明确b-AP15对食管癌细胞的增殖抑制效果,阐明b-AP15在食管癌中可能的抗肿瘤分子机制,为食管癌的诊断和治疗提供新的思路与理论基础。材料与方法1.通过CCK-8、平板克隆形成实验和细胞形态学观察检测b-AP15对食管鳞癌细胞EC1和Kyse 450增殖的抑制作用。2.通过PI染色流式细胞术测定不同浓度的b-AP15(0.4μM、0.6μM、0.8μM)处理食管鳞癌细胞EC1和Kyse 450后,对细胞周期和凋亡的影响,同时用Western blot的方法检测b-AP15作用后细胞周期相关蛋白、促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白的变化。3.使用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)测定不同浓度的b-AP15(0.4μM、0.6μM、0.8μM)处理对两种肿瘤细胞线粒体膜电位的影响,用FITC-DEVD-FMK探针法检测总凋亡蛋白酶caspase 3的激活情况,Western blot检测c-PARP和c-caspase 3的表达,以DMSO为对照。4.用流式细胞术检测基因沉默Noxa后对b-AP15引起的细胞凋亡率的影响,确定Noxa的作用。5.用Q-PCR的方法测定b-AP15作用后促凋亡相关蛋白Noxa的m RNA水平变化,Western blot检测Myc的表达情况,并用流式细胞术检测调节Noxa基因表达的上游调控分子Myc后对b-AP15引起的细胞凋亡率的影响。用免疫印迹(Western Blot)的方法检测沉默Myc(Noxa的上游调控分子)后Noxa蛋白的变化。结果1.CCK-8法、形态学观察以及平板克隆实验的结果显示,b-AP15对两种食管癌细胞都有明显的增殖抑制作用,且呈现浓度依赖性。2.细胞周期结果显示,b-AP15处理后EC1和Kyse 450细胞阻滞在G2/M期。同时用Western blot检测细胞周期相关蛋白的变化,发现G2/M期相关蛋白p21、p27和p Wee1增加,而G1期标志性蛋白cyclin A,cyclin D没有明显变化,同时促凋亡蛋白Noxa明显增加,其他促凋亡蛋白家族和抑凋亡蛋白家族的蛋白表达无明显改变改变。3.Annexin V-FITC/PI双染法及caspase 3活性检测评估细胞凋亡率,结果表明b-AP15诱发细胞发生明显的凋亡,总凋亡率,包括早期和晚期凋亡率,随药物浓度增高而上升。通过Western blot检测发现b-AP15处理引起凋亡标志性蛋白,如c-PARP和c-caspase 3的表达增加,呈剂量依赖性。JC-1染色流式分析发现b-AP15处理导致线粒体膜电位下降。以上这些结果提示b-AP15促进食管癌细胞凋亡,并且线粒体源性凋亡通路在其中发挥一定的作用。4.Q-PCR检测发现b-AP15处理细胞后促凋亡相关蛋白Noxa的m RNA表达水平明显升高,与Western blot检测结果一致。5.RNA干扰沉默Noxa或Myc,细胞的凋亡率均有所下降。Western Blot结果显示b-AP15处理后Myc的表达水平增加,RNA干扰沉默Myc后Noxa的表达水平下降。这些结果提示Noxa很可能是b-AP15引起细胞凋亡的关键作用分子。结论1.在食管癌细胞EC1和Kyse 450中,b-AP15通过阻滞细胞周期和促进细胞凋亡抑制细胞增殖。2.b-AP15处理使Myc的表达水平升高,而Myc作为转录因子上调促凋亡蛋白Noxa的表达,进而诱导线粒体依赖的凋亡。