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水稻抗病相关基因的克隆有助于阐明水稻抗病的分子机制。Xa23是章琦等人从我国普通野生稻Oryza rufipogon)中鉴定出来的1个新的白叶枯病抗性基因,并已育成以感病籼稻品种JG30为遗传背景的近等基因系CBB23。本研究以JG30和CBB23为材料,通过mRNA差异显示技术和基于同源序列的候选基因法,对抗、感近等基因系材料接种病原菌后1、3、5、7、10天得到的cDNA进行RT—PCR分析,分离在抗、感近等基因系间差异表达的cDNA片段,期望找到与抗病基因连锁或相关的基因片段,为克隆Xa23基因提供条件。 通过mRNA差异显示技术获得5个在抗、感近等基因系间差异表达的cDNA片段。其中片段CU10在感病材料JG30接种病菌后1～10天期间的表达量基本不变,而在抗病近等基因系CBB23接种病菌后的同一时段内所表达量普遍大于感病材料,而且其表达量随着接种病菌后时间的延长增强。序列同源性比对结果表明:CU10与水稻接种稻瘟病菌6、24小时后获得的4个EST序列(CB663801、CB658079、CB651075、CB648338)有99%(368/369)的同源性。据此推测,CU10序列来源于水稻基因组,其表达受到病原菌的诱导,其产物可能是水稻抗病信号传导途径中某种共同因子。将其电子定位到水稻第2号染色体。其它4个cDNA差异片段,在GeneBank中未搜索到具有明显同源性的序列,推测可能是新的cDNA片段。 根据STK类抗病基因保守区设计引物,从抗、感近等基因系中均扩增出一条472bp大小的条带,序列分析表明:该片段与通过差异显示方法所获得的CU10是同一序列,根据与其高度同源的EST序列,将其延长为1030bp,记为RTK;多序列比对显示,RTK上游序列与水稻接种稻瘟病菌6、24小时后获得的EST完全相同,而与未接种对照差别较大;下游序列在对照与接种病原菌后得到的EST之间没有差别。通过设计引物,在抗病的CBB23中扩增出RTK全长序列,而在感病亲本JG30中没有扩增出条带;证实了电子延长的正确性,同时也说明RTK基因与抗病性存在着某种联系。RTK有一个完整的开放阅读框,其编码的蛋白质具有信号肽和跨膜结构域,可能是一个具有磷酸化功能的跨膜蛋白。 根据NBS-LRR类抗病基因保守区设计引物,从抗、感近等基因系中扩增出一条500bp大小的条带,测序后获得了2类不同的NBS-LRR类抗性基因同源序列,其中NB1长514bp,电子定位于第11号染色体6978.5K～6979.1K处;NB2长505bp,电子定位于第11号染色体29707.9K～29708.5K处。二者的DNA序列同源性只有30%,但编码的氨基酸序列均具有NBS-LRR类抗性基因的典型保守结构,同源性搜索显示与已克隆的NBS-LRR类抗性基因同源序列有较高的同源性,说明NR1和NB2是NBS—LRR类抗性基因同源片段。它们与抗病性的关系有待获得全长cDNA序列后再进行分析鉴定。 根据胞外LRR类抗病基因保守区设计引物,从抗、感近等基因系中获得了2个RGA序列:LR1和LR2。序列分析发现,LR1和LR2不具有LRR类抗病基因的典型保守结构域。推测两片段与目的抗性基因无关。 对图位克隆法获得的4个抗病候选基因进行RT-PCR分析,表明4个候选基因在转录水平上均有表达。