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研究背景与目的阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(Obstructive sleep apnea syndrome,OSAS)是一种常见疾病,主要表现为睡眠状态下反复出现呼吸暂停和低通气,其重要病理生理学改变是反复呼吸暂停形成的慢性间歇性低氧(Chronic intermittent hypoxia,CIH)。CIH引发机体一系列氧化应激与炎症反应致血管内皮损伤,显著增加冠状动脉动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病的风险。氧化应激与炎性反应的生物活性物质主要来源于激活的多形核粒细胞(polymorphonuclear PMN),PMN易被各种刺激因素包括CIH所激活,且PMN占循环白细胞总数的近60%,与血管内皮细胞接触多、接触直接。PMN与内皮细胞的相互作用是多种疾病的病理生理学基础。为此,本实验通过分离常氧大鼠和CIH暴露大鼠的PMN分别与常氧及CIH暴露的大鼠主动脉内皮细胞共培养,采用直接共培养及transwell共培养方式,通过观察TNF-α及NF-κB,探讨CIH环境下PMN与内皮细胞的相互作用及机制。为临床上预防和治疗OSAS及其合并症提供理论依据。内容1.不同间歇低氧暴露条件下内皮细胞与中性多核白细胞共培养上清中TNF-α水平比较2.不同间歇低氧暴露条件下内皮细胞与中性多核白细胞共培养后内皮细胞中NF-κB水平比较方法8周龄雄性Wistar大鼠18只,随机分为常氧对照组和间歇低氧组。CIH组暴露于间歇低氧环境中,氧浓度波动于5.4%-20.7%,低氧频率为30次/h,8 h/d,以模拟OSAS患者间歇低氧的过程。常氧对照组舱内充入相应频率及流量变化的压缩空气,持续时间6周[1]。6周后处死大鼠,腹主动脉取血,双层Ficoll-Histopaque密度梯度离心法分离纯化PMN。纯化的PMN在RPMI-1640培养基中重悬,调整细胞浓度为1 x 106/ml[2],用于与大鼠主动脉内皮细胞共培养。大鼠主动脉内皮细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养。内皮细胞间歇低氧组暴露于间歇低氧环境中,300秒为一循环,每个循环的前45秒向细胞低氧舱内输入含5%co2、1.5%o2、93.5%n2的混合气体,接下来255秒输入含5%co2、21%o2、74%n2的混合气体以模拟体内内皮细胞间歇低氧的过程,周而复始形成48次循环,共4小时,每小时事件数为12次[3]。共培养方式分为直接共培养和tanswell共培养。直接共培养为pmn细胞悬液按比例直接加于接种有鼠主动脉内皮细胞的细胞培养孔中;transwell共培养为在细胞培养孔中置入transwell小室,于小室中加入相同体积的pmn细胞悬液。共培养的pmn与内皮细胞的比率约为10:1[2]。细胞加样结束后将细胞培养板置于标准细胞培养箱中,共培养4小时。共培养结束后提取培养上清,elisa法测定上清中的tnf-α,westernblotting测定内皮细胞中nf-κbp65浓度。共培养分组如下:1.常氧内皮细胞+等体积细胞培养液组(transwell共培养)2.常氧内皮细胞+等体积细胞培养液组(直接共培养)3.cih内皮细胞+等体积细胞培养液组(transwell共培养)4.cih内皮细胞+等体积细胞培养液组(直接共培养)5.常氧内皮细胞+常氧pmn组(transwell共培养)6.常氧内皮细胞+常氧pmn组(直接共培养)7.cih内皮细胞+常氧pmn组(transwell共培养,单纯内皮细胞激活)8.cih内皮细胞+常氧pmn组(直接共培养,单纯内皮细胞激活)9.常氧内皮细胞+cihpmn组(transwell共培养,单纯pmn激活)10.常氧内皮细胞+cihpmn组(直接共培养,单纯pmn激活)11.cih内皮细胞+cihpmn组(transwell共培养,内皮细胞和pmn均激活)12.cih内皮细胞+cihpmn组(直接共培养,内皮细胞和pmn均激活)结果tnf-α1.不同培养方式下组内比较,除cih内皮细胞+cihpmn组外,两种不同培养方式培养方式上清中的tnf-α水平无显著差异。cih内皮细胞+cihpmn直接共培养组培养上清的tnf-α浓度高于traswell组(p=0.010)。2.直接共培养方式下各组比较,不同cih暴露组和常氧内皮细胞+常氧pmn组比较,tnf-α水平均升高(均p<0.05),以cih内皮细胞+cihpmn组最高,且与cih内皮细胞+常氧pmn组及常氧内皮细胞+cihpmn组比较,tnf-α水平差异有统计学意义(均p<0.05),cih内皮细胞+常氧pmn组及常氧内皮细胞+cihpmn组间比较,前者表达tnf-α水平更高(p<0.05)。3.transwell共培养方式下各组比较,不同cih暴露组和常氧内皮细胞+常氧pmn组比较,tnf-α水平均升高(均p<0.05),以cih内皮细胞+cihpmn组最高,且与cih内皮细胞+常氧pmn组及常氧内皮细胞+cihpmn组比较,tnf-α水平差异有统计学意义(均p<0.05),cih内皮细胞+常氧pmn组及常氧内皮细胞+cihpmn量组间比较,前者表达tnf-α水平更高(p<0.05)。4.常氧内皮细胞+等体积细胞培养液组与常氧内皮细胞+常氧pmn组比较,以及cih内皮细胞+等体积细胞培养液组与cih内皮细胞+常氧pmn组比较,两种共培养方式下tnf-α浓度差异无统计学意义。5.常氧内皮细胞+等体积细胞培养液组及cih内皮细胞+等体积细胞培养液组transwell共培养与直接共培养比较,tnf-α浓度差异无统计学意义。nf-κbp651.不同培养方式下组内比较,内皮细胞与常氧pmn共培养,直接共培养组与transwell共培养组表达的nf-κbp65量无差异(p>0.05),内皮细胞与cihpmn组直接共培养组比transwell共培养组表达更多的nf-κbp65,具有统计学差异(p<0.05)。2.直接共培养方式下组间比较,cih内皮+常氧pmn组与常氧内皮+cihpmn组nf-κbp65表达量无统计学差异(p>0.05),但两组均较常氧内皮+常氧pmn组显著升高。cih内皮+cihpmn组nf-κbp65表达量较其余三组显著升高(p<0.05)。3.transwell共培养方式下组间比较,常氧内皮细胞+常氧pmn组、常氧内皮细胞+cihpmn组、cih内皮细胞+常氧pmn组、cih内皮细胞+cihpmn组nf-κbp65量依次增高,且各组间两两比较均有统计学差异(p均<0.05)。结论1.cih可直接损伤内皮细胞启动nf-κb炎症通路,该炎症通路的激活亦可通过cih激活pmn再进一步作用于内皮细胞。2.nf-κbp65及tnf-α水平在单一内皮细胞激活组高于单一pmn激活组,尽管并非所有组均有显著的统计学意义,提示在osas患者内皮细胞损伤机制中,cih直接损伤内皮细胞可能占有更主要的地位。3.pmn与内皮细胞transwell共培养时表达的炎症因子增高,提示pmn的间接分泌作用与这种损伤机制有关。当两种细胞直接共培养时,表达的炎症因子亦增高,且直接共培养时所表达的炎症因子趋势上要高于transwell共培养时,提示直接黏附作用可能同时与这种损伤机制有关。