石斑鱼半乳糖凝集素基因的克隆、表达及功能分析

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石斑鱼肉质鲜美,营养丰富,脂肪含量低,是我国及东南亚地区重要的海水养殖经济鱼类。但随着高密度水产养殖业的快速发展,导致水污染日益加剧,致使各种水产病害大规模爆发,给石斑鱼养殖业造成巨大经济损失,严重制约着石斑鱼产业的可持续发展。因此,研究石斑鱼自身免疫相关基因及其机制,提高其免疫力和抗病力,对石斑鱼的健康养殖至关重要。凝集素通过介导蛋白质-碳水化合物的相互作用而成为动物先天免疫的重要组成部分。半乳糖凝集素作为凝集素家族成员,其进化保守、组织分布广,并且在特定组织中含量丰富,参与细胞粘附、信号转导、细胞基质相互作用及免疫反应等多种生物学过程。本论文首次对石斑鱼半乳糖凝集素1、8和9基因进行了克隆、表达及功能分析,研究表明这些基因在宿主抵御病原感染的免疫反应中发挥了重要的作用,这不仅丰富了石斑鱼先天性免疫的内容,也可为鱼类疾病的防治及鱼苗的选育提供新的策略及理论依据。取得的主要研究成果如下:  1、从斜带石斑鱼中克隆到一种S型凝集素基因,命名为EcGlec-1,其cDNA全长504bp,ORF区408bp,编码135个氨基酸,与条石鲷galectin-1基因的同源性最高;qRT-PCR分析表明EcGlec-1主要分布在肌肉、心脏、脾脏和头肾中。SGIV、LPS、polyI:C刺激后,石斑鱼脾脏EcGlec-1的表达量呈不同程度的升高。成功表达并纯化了重组蛋白(rEcGlec-1),制备了多克隆抗体。rEcGlec-1蛋白能使石斑鱼和鸡血红细胞凝集,能结合革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。亚细胞定位分析表明EcGlec-1主要在细胞质中表达,细胞核少量表达。WST-1比色法检测细胞毒性表明重组蛋白rEcGlec-1能够有效地中和新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)对细胞的毒性,有效的保护细胞的生长。成功筛选得到稳定表达EcGlec-1的细胞系,抗病毒分析实验结果表明EcGlec-1能抑制SGIV感染的CPE进程,降低病毒主要衣壳蛋白MCP的表达。  2、成功克隆了两种半乳糖凝集素EcGlec-8和9的部分cDNA全长;qRT-PCR分析表明EcGlec-8和9主要表达在脾脏、肾脏和头肾等组织;石斑鱼经SGIV、polyI:C和LPS刺激后EcGlec-8和9在头肾的表达量都有不同程度的上调。成功构建了EcGel-8的原核表达重组质粒,并在成功获得了水溶性较好的重组蛋白(rEcGlec-8)。
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