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目的: DupA蛋白是近几年新发现的H.pylori毒力因子，由dupA基因编码。DupA蛋白可以升高十二指肠溃疡发病率，降低胃癌的发病风险，但该结论存在争议。目前国内外缺乏对dupA基因功能及其编码蛋白DupA致病机制的研究报道。 本文以H.pylori的dupA基因为研究对象，使用生物信息学、微生物学、免疫学和分子生物学等技术探讨dupA基因的功能及其编码蛋白DupA致病机制，为深入研究H.pylori的致病机制奠定基础。 方法: 1.采用PCR扩增的方法分离H.pylori WH-21菌株携带的dupA基因，获得目的基因片段并测序。使用生物信息学软件:ProtParam、ANTHEPROT5.0、SignalP4.1 server、PSORTb3.0.2对其基本的理化性质、信号肽和细胞定位进行预测分析;用NPSA_server在线软件预测分析DupA蛋白的二级结构;用Phyre2.0进行DupA蛋白三级结构配体的预测。 2.构建表达载体pET-32a-dupA，使用诱导剂(IPTG)在最佳条件下诱导表达融合蛋白;蛋白纯化后用Western blot法进行鉴定。 3.用纯化好的融合蛋白制备兔抗DupA多克隆抗体，酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定抗体效价。 4.利用同源重组原理，构建dupA基因缺失自杀质粒pBlueKM40-ΔdupA∷kan，电击转入感受态WH-21中，抗性筛选出阳性克隆，PCR验证，获得dupA基因缺失株。 5.收集并裂解WH-21细菌菌体，用超高速低温离心法获得不同的亚细胞组分，一抗使用上述制备的多克隆抗体，Western blot检测DupA蛋白亚细胞定位。 6.胃上皮细胞GES-1与dupA基因缺失株和野生株WH-21共培养，使用Western blot检测转运的CagA蛋白含量，研究dupA基因缺失对Ⅳ型分泌系统转运CagA蛋白的影响。 7.采用免疫共沉淀实验和质谱分析方法，进行DupA蛋白的互作蛋白分析。 结果: 1.H.pylori WH-21菌株dupA基因全长为2499bp，编码蛋白长度为832aa，相对分子质量为96.30kDa，等电点为8.46，属于稳定蛋白，亲水性强;存在多个跨膜区且没有信号肽存在;细胞定位预测提示DupA蛋白定位在胞膜;α螺旋是DupA蛋白多肽链中主要的组成结构元件;配体结合位点分析表明，DupA蛋白结合位点的物质为ADP、ATP和Mg2+并且与CagE_TrbE_VirB超家族有较高的同源性。 2.构建成功原核表达载体pET-32a-dupA，经过IPTG诱导及QIAGEN系统纯化后获得目的蛋白。 3.免疫家兔获得了兔抗DupA多克隆抗体，效价为1∶6.4×104。 4.构建成功dupA基因敲除重组自杀质粒pBlueKM40-ΔdupA∷kan。电转化自杀质粒进入H.pylori WH-21菌体内，通过卡那霉素抗性筛选及PCR验证得到H.pylori dupA基因缺失株即ΔdupA。 5.以兔抗DupA多克隆抗体为一抗作Western blot分析，确定DupA蛋白定位于胞膜。 6.H.pylori与GES-1做共培养，检测CagA蛋白转运量，结果显示dupA基因缺失株和野生株向胞内转运CagA蛋白无差别。 7.经过免疫共沉淀实验和质谱分析，DupA蛋白的互作蛋白为脲酶和HSP60。 结论: 1.成功克隆了dupA全长基因，并完成测序，使用生物信息学方法了解了其编码蛋白的基本特性，包括该蛋白一级结构、二级结构和三级结构特征及该蛋白细胞定位和功能结构域等。 2.成功构建了dupA基因的原核表达载体pET-32a-dupA，经诱导纯化获得目的蛋白，免疫家兔后获得兔抗DupA多克隆抗体。 3.成功构建了dupA基因敲除重组自杀质粒并通过筛选获得了一株dupA基因缺失株即AdupA。 4.DupA蛋白可能独立于CagPAI之外且存在于H.pylori胞膜，不参与CagA蛋白的转运，DupA蛋白与脲酶及HSP60存在互作关系。