背景1982年Mulliken和Glowacki根据脉管性疾病的临床表现、组织病理学特征和生物学行为将其分为两大类：血管畸形和血管瘤。血管畸形与血管瘤最大的区别是：血管畸形出生时出现,随身体发育相应的生长,没有自然消褪迹象；而血管瘤出生时表现为小红点或小红斑,大部分在2周开始增长,3-6个月内生长明显,9-12月达到高峰,12-18个月出现消褪,90%在9年内消失。同时后者常见于婴幼儿,所以主张用“婴幼儿血管瘤”来命名从而更有利于对这类疾病的理解。病理学上婴幼儿血管瘤主要表现为增殖期内皮细胞大量的自我克隆增殖和微血管形成,消褪期内皮细胞消散、微血管塌陷、脂肪和纤维组织堆积。故许多研究者致力于研究内皮细胞来源、微血管形成机制及消褪期内皮细胞凋亡原因,而近来研究表明婴幼儿血管瘤中含有的丰富非内皮细胞也积极参与到此病理演变过程中。有资料表明婴幼儿血管瘤中树突状细胞通过分泌细胞因子VEGF参与血管瘤的形成；增生期肥大细胞释放VEGF、Ⅷ型胶原刺激血管形成,促进血管瘤的增生；Ritter等发现缺氧会刺激增生期髓样细胞分泌血管生成因子而促进微血管形成。作为一种免疫相关细胞,巨噬细胞同样大量存在于血管瘤中,其分布变化和作用却鲜有报道。免疫学研究表明巨噬细胞是一种具有可塑性和多能性的细胞群体,在不同细胞因子的诱导下表现出明显的功能差异。巨噬细胞主要分为Ml型即经典活化型巨噬细胞和M2型即替代激活型巨噬细胞。M1型巨噬细胞主要分泌IL-23、IL-12和支持Thl激活,从而具有呈递抗原、吞噬异物、杀灭微生物和肿瘤细胞的能力,达到抗增殖、抗肿瘤的作用；相反M2型巨噬细胞可产生IL-8、VEGF、bFGF等血管因子,促进微血管的生成,同时分泌各种蛋白酶女口MMPs、MMP-9和upA来降解细胞外基质,为新生血管向正常组织中迁移创造有利条件,起到促进血管、淋巴生长,帮助肿瘤迁移的作用。既然婴幼儿血管瘤存在一个明显的增殖与消褪过程,同时有研究表明其中又含有丰富巨噬细胞,那么在增殖期出现的是不是M2型巨噬细胞?随着进入消褪期,在局部微环境改变的情况下,是不是也存在着从M2型向M1型转变的可能性,进而反过来促进婴幼儿血管瘤从增殖向消褪状态转变?如能观察到这一变化,将为深入研究巨噬细胞如何调控婴幼儿血管瘤的增殖与消褪提供理论基础,进而为临床干预开启一有意义的治疗途径。就目前而言,尚未见研究婴幼儿血管瘤不同时期巨噬细胞分布及表型变化的报导。目的通过检测不同时期婴幼儿血管瘤中的巨噬细胞类型,探讨其在增殖与消褪病理变化过程中的分布及表型变化规律,为深入研究巨噬细胞在婴幼儿血管瘤中调控微血管生长的机制提供依据。方法1.收集标本,进行Glut一1检测,排除血管畸形标本收集赣南医学院第一附属医院病理科诊断为血管瘤的标本46例。参照袁斯明等的方法将标本分为4个阶段：增生早期(1-3个月,7例)、增生中期(4-6个月,17例)、增生晚期(7-12个月,16例)、消退早期(1-3岁,6例)。进行Glut—1免疫组化标记,区分婴幼儿血管瘤和血管畸形,同时行常规HE染色,比较两者病理特点。2.婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖活性检测利用Ki-67行免疫组化检测,内皮细胞阳性率大于10%为阳性表达,探讨内皮细胞增殖活性高低在分期和预测婴幼儿血管瘤是否消褪中的意义。3.检测婴幼儿血管瘤中巨噬细胞表型用CD68、CD16/32、CD163分别标记非特异性巨噬细胞、M1型和M2型巨噬细胞,观察在血管瘤组织中的分布及变化。4.统计学处理采用SPSS14.0统计软件进行分析,多组均数间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差不齐用Welch法进行矫正；差异有统计学意义时,方差齐用SNK法两两比较,方差不齐用Dunnett T3方法两两比较。结果1.43例标本内皮细胞Glut一1表达阳性,确定为婴幼儿血管瘤,3例阴性,为血管畸形。病理表现：婴幼儿血管瘤瘤体被厚薄不一的纤维组织分隔而呈“分叶状”,血管畸形无“分叶状”结构。增生早期“分叶状”结构从中央到边缘大致可分为三个“区”,中心幼稚区、中间过渡区和边缘分化成熟区；到增生晚期和消褪早期,三个区的结构逐渐难以分辨。2.43例婴幼儿血管瘤标本,Ki-67表达阳性率均低于10%,为阴性表达。3.CD68阳性巨噬细胞(非特异性巨噬细胞)在婴幼儿血管瘤各期中均有出现；4期之间差异有统计学意义(F=12.815,P=0.000),增生早期、增生中期和增生晚期三期之间相比无统计学意义(P>0.05),三期与消褪早期之间相比有统计学意义(P<0.05),且高于后者。CD163阳性巨噬细胞(M2型巨噬细胞)增生早期阳性表达率为20.93%,主要出现于小于3个月的血管瘤标本中,大于3个月阳性表达迅速减弱；增生早期和增生中期的95%可信区间未包括0,与增生晚期和消褪早期之间差异有统计学意义,比较增生早期和增生中期两者之间差异有统计学意义(t=7.778,P=0.000),且前者高于后者,可见M2型巨噬细胞主要在增生早期发挥作用。CD16/32阳性巨噬细胞(M1型巨噬细胞)在增生早期未见表达,少量增生中期标本中开始出现阳性表达,与M2型巨噬细胞出现无明显交集,增生晚期逐渐增强阳性率为8.07%；增生晚期的95%可信区间未包括0,与增生早期和消褪早期之间差异有统计学意义；增生中期的95%可信区间包括0,与增生早期和消褪早期之间差异无统计学意义；比较增生晚期和增生中期两者之间差异有统计学意义(t=22.853,P=0.000),且前者高于后者,可见M1型巨噬细胞主要在增生晚期发挥作用。讨论1.血管瘤和血管畸形病理表现区别及意义目前我国许多医院仍未对血管瘤和血管畸形进行明确区分,而是统称为血管瘤,故在我们收集的标本中极有可能混杂着血管畸形标本,将其剔除才能保证后面实验顺利进行。虽然根据临床表现可将两者分开,但病理学上的区别应更为客观。2000年North等发现在婴幼儿血管瘤的各个时期Glut-1都有显著性表达,而在其它血管肿瘤或畸形中表达不明显,从而将Glut-1作为婴幼儿血管瘤区别于血管畸形特殊而有用的免疫组化标记。我们在实验中再次证实了这一结果,各期婴幼儿血管瘤标本内皮细胞Glut-1染色均成阳性,而血管畸形为阴性,从而客观地将两者区分。通过观察婴幼儿血管瘤和血管畸形在病理表现上的不同,本实验发现前者瘤体被厚薄不一的纤维组织分隔而呈“分叶状”,后者病灶无边界,无“分叶状”结构,主要由大小不等的血管组成。故此“分叶状”的结构特点应该可以作为病理上鉴别两者的标准之一进一步研究发现,每一“叶”细胞及组织分布有相似的特点,即从中央到边缘可分为三个“区”：中心幼稚区、过渡区和边缘成熟区,尤其在增生早期表现特别明显。这一病理结构特点可能有助于我们进一步了解婴幼儿血管瘤中增生微血管的来源机制。血管的生成主要有两种机制：血管发生和血管形成。血管发生(vasculogensis)是指由成血管细胞发育成原始的血管；血管形成(angiogenesis)是指毛细血管由已存在的血管中发芽长出。起初,象其它肿瘤一样,血管形成被认为是婴幼儿血管瘤微血管的主要来源；2004年Nguyen发现,婴幼儿血管瘤中微血管结构和对单核细胞或巨噬细胞或树突细胞标记染色呈阳性的血管周围细胞共同出现,从而提出微血管是血管发生而非血管形成的结果；我们通过对增殖期婴幼儿血管瘤标本进行整体观察和分析“分叶状”结构演变过程特点,可以想象,血管瘤中被纤维组织分隔的内皮细胞团作为一个发生中心,在不断增殖膨胀的同时,重组排列生成新的微血管,并向周围组织扩展,在移行过程中不断地修整、改建,进化成成熟血管,从而更简洁明了地表明婴幼儿血管瘤中微血管主要来源于血管发生的结果。2.婴幼儿血管瘤增殖活性与预后1987年Bauer等首次证明了增殖活性在肿瘤预后中的重要作用,随后Schutte等进一步提出肿瘤细胞增殖活性可以作为判断预后的独立指标。增殖期婴幼儿血管瘤内皮细胞具有自我克隆性,检测其增殖活性,对婴幼儿血管瘤的分期、预后具有重要意义。实验表明婴幼儿血管瘤内皮细胞Ki-67呈持续性低水平表达,不足10%,为阴性表达,说明实验标本代表的婴幼儿血管瘤病例增殖活性不高。这一结果使我们推测：1、因患者大部分是婴幼儿,手术人员在前期选择病人时就有意无意将临床上增生范围广泛、快速,难以切除的病例排除在外,而是选择病灶局限、增长缓慢、易于切除的患儿进行手术。2、标本代表的这部分病例内皮细胞自我克隆增殖难以跟上向微血管演变的速度,临床上可能更早地进入消褪期,残留的畸形也应更不明显,预后较好,反而不需要早期积极干预,应以保守治疗为王。3.巨噬细胞在婴幼儿血管瘤中的作用婴幼儿血管瘤有其独特自然病史,病理上主要是内皮细胞和微血管的变化,因而以往多致力于研究内皮细胞方面,探讨其起源和如何生成微血管,而近来研究表明,婴幼儿血管瘤中含有的丰富非内皮细胞也积极参与到病理演变过程中。巨噬细胞作为一种免疫相关细胞,同样大量出现于婴幼儿血管瘤中,也应在其中发挥重要作用。免疫学研究表明巨噬细胞是一种具有可塑性和多能性的细胞群体,在不同细胞因子诱导下表现出明显的功能差异。其中M1型巨噬细胞具有呈递抗原、吞噬异物、杀灭微生物和肿瘤细胞的能力,从而达到抗增殖、抗肿瘤的作用；而M2型巨噬细胞起到促进血管、淋巴生长,帮助肿瘤迁移的作用。我们研究显示增生早期巨噬细胞大量出现于内皮细胞团外围并聚集于新生血管周围；在增生中期巨噬细胞数量减少,向瘤体内弥散；进入增生晚期、消退早期巨噬细胞数量明显稀少,散布于微血管、细胞之间。表明巨噬细胞存在于各个阶段,参与了婴幼儿血管瘤增殖与消褪的病理变化过程,而观察其表型变化,有助于进一步判断其是否对血管瘤演变产生影响。通过特异性标记CD163发现,聚集于早期婴幼儿血管瘤新生血管周围的巨噬细胞为M2型。根据以往报道M2型巨噬细胞可产生各种血管因子,促进微血管的生成,同时分泌各种蛋白酶来降解细胞外基质,为新生血管向正常组织中迁移创造有利条件,此时大量出现使我们有理由相信其在血管瘤增殖早期微血管生成中扮演着重要角色。同时增生晚期和消褪早期标本中发现CD16/32阳性M1型巨噬细胞,有资料显示其可分泌各种细胞因子,直接或间接作用于成纤维细胞和周围组织细胞,导致纤维化的形成,恰与病理上同阶段脂肪组织与纤维组织开始增多相吻合。不同病理时期相应类型巨噬细胞的出现,表明婴幼儿血管瘤中的巨噬细胞在微环境改变下有可能从致增殖的M2型向促消褪的M1型演变,从而实现功能转化,可见若能通过人为干预,将M2型尽早转化为M1型,势必加速血管瘤的消褪,进而为临床开启一有意义的治疗途径。同时Mantovani和Naito等认为巨噬细胞的功能状态存在连续性,而M1型和M2型巨噬细胞只是这一连续状态的两个极端,其间还有其它类型巨噬细胞存在,由此我们推测,在婴幼儿血管瘤病理演变过程中也可能有其它类型巨噬细胞参与。本研究利用免疫组化首次探讨并证实了巨噬细胞存在于婴幼儿血管瘤增殖与消褪的病理演变过程中,并检测到增殖和消褪期有相应表型出现。这不仅为深入研究巨噬细胞在婴幼儿血管瘤中对微血管的生长调控机制提供了有意义的依据,而且对于进一步了解如何诱导其表型的变化,进而应用于临床治疗提供了一种有意义的尝试。结论1.婴幼儿血管瘤和血管畸形在病理形态上有着截然不同的表现,“分叶状”病理结构可以作为鉴别诊断两者的参考指标之一；“分叶状”结构的病理演变过程可能表明婴幼儿血管瘤的微血管主要来源于血管发生的结果；Glut—1可作为鉴别婴幼儿血管瘤和血管畸形的客观标记,从而剔除血管畸形病例,保证实验所用标本为婴幼儿血管瘤病例。2.Ki-67的低表达可能说明,实验标本代表的这类面积小、生长速度慢和易于切除的婴幼儿血管瘤病例,增殖活性不高,易于消褪,预后较好,反而不需要早期积极干预。3.巨噬细胞存在于婴幼儿血管瘤的各个时期,早期出现的为M2型巨噬细胞,增生晚期和消褪早期出现的为M1型巨噬细胞。不同病理时期相应类型巨噬细胞的出现,表明婴幼儿血管瘤中的巨噬细胞在微环境改变下有可能从致增殖的M2型向促消褪的M1型演变,从而实现功能转化。