结肠癌是发生于结肠部位的常见的消化道恶性肿瘤,占胃肠道肿瘤的第三位,近年来,结肠癌的发病率与病死率在我国呈上升的趋势,达到或超过了西方发达国家的平均水平,其发病年龄在40岁以上,高发年龄普遍在50～60岁,比西方国家平均提早10岁。目前结肠癌临床治疗主要以手术为主,同时有目的的结合放疗和化疗。结肠癌5年生存率为74%,根治手术率为85%。但是对于有些失去手术机会,又不能耐受化疗毒副作用的患者,迫切需要寻找或开发出新型的抗肿瘤药物。蜂毒是蜜蜂工蜂毒腺和副腺分泌的透明毒液,民间利用蜂毒治疗类风湿性关节炎已有悠久的历史。蜂毒素是从蜂毒中提取的一种小蛋白分子,约占蜂毒干重的50%,具有很强的生物活性。随着现代分子生物科学技术的发展,基因工程蜂毒素技术已经很成熟,并通过体内外实验,验证其具有生物学活性。蜂毒素具有抗肿瘤作用,能抑制消化道肿瘤的生长,促进肿瘤细胞的凋亡。国内外关于蜂毒素抑制肿瘤细胞增殖、转移,诱导凋亡的研究尚未完全阐明,课题组前期研究发现蜂毒素能通过线粒体通路抑制胃癌细胞转移,诱导胃癌细胞的凋亡,本研究拟通过细胞、分子、动物水平探究基因工程蜂毒素给药的最佳药物浓度及治疗效果,旨在探讨蜂毒素体内外抑制结肠癌的机制。研究内容分为三部分:第一部分天然蜂毒素抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的实验研究目的:通过不同浓度的蜂毒素抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的生长,探讨蜂毒素对小鼠结肠癌CT-26细胞的迁移和凋亡的影响及其分子机制。方法:MTT法检测不同浓度蜂毒素(1、2、4、8和16μg/mL)分别作用小鼠结肠癌CT-26细胞不同时间(1、2、4、8h)后细胞增殖情况;Transwell小室实验检测蜂毒素(1、2μg/mL)作用小鼠结肠癌CT-26细胞lh后迁移能力的情况;流式细胞术检测蜂毒素(1、2μg/mL)作用CT-26细胞1h后诱导细胞凋亡情况;Western Blot检测蜂毒素(1、2μg/mL)作用1h后小鼠结肠癌CT-26细胞线粒体通路中Caspase-9,Caspase-3和PARP的蛋白水平。结果:MTT结果显示蜂毒素能够有效抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的生长,随着浓度的增大和作用时间的延长,抑制率逐渐增高,趋近100%,当蜂毒素浓度分别为1和2μg/mL作用1h,抑制率分别达到24.83%、58.16%,与对照组相比差异显著(P<0.01)。Transwell小室实验结果显示,经1和2μg/mL蜂毒素处理细胞1h后,CT-26细胞穿膜数分别为192个和53个,较对照组207个明显减少,并呈一定的浓度依赖性(P<0.01)。细胞凋亡检测结果显示,经1和2μg/mL的蜂毒素处理后1h,CT-26细胞凋亡率分别为8.5%、11.3%,较对照组凋亡率5.3%明显升高并呈一定的浓度依赖性(P<0.01)。Western Blot结果显示,经1和2μg/mL蜂毒素处理小鼠结肠癌CT-26细胞1h后,细胞上清中,Caspase-9相对表达量分别为1.07和0.46,较对照组2.25明显降低,呈一定的浓度依赖性(P<0.01),Caspase-3相对表达量分别为3.72和2.33,较对照组11.03明显降低,呈一定的浓度依赖性(P<0.01),PARP相对表达量分别为1.23、1.10,较对照组1.80明显降低,并呈一定的浓度依赖性(P<0.01)。结论:当蜂毒素浓度分别为1、2μg/mL,作用小鼠结肠癌CT-26细胞1h后,就能明显抑制细胞的增殖、迁移、并诱导细胞凋亡,其机制可能与下调Caspase-9,Caspase-3和PARP蛋白水平直接相关。第二部分携带蜂毒素基因的减毒沙门氏菌体外抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的实验研究目的:通过不同浓度的各组菌抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的生长,探讨携带蜂毒素基因的减毒沙门氏菌(Mel菌)对小鼠结肠癌CT-26细胞的迁移和凋亡的影响及其分子机制。方法:MTT法检测不同浓度的Mel菌及减毒沙门氏菌(X4550菌)、携带荧光基因的减毒沙门氏菌(GFP菌)(15、20、25、30、35、40、45和50CFU/细胞)分别作用小鼠结肠癌CT-26细胞24、48h后细胞增殖影响;Transwell小室实验检测Mel菌25CFU/细胞、对照组X4550菌45CFU/细胞和对照组GFP菌30CFU/细胞作用小鼠结肠癌CT-26细胞24h后迁移能力的情况;流式细胞技术检测Mel菌25 CFU/细胞、对照组X4550菌45 CFU/细胞和对照组GFP菌30CFU/细胞作用CT-26细胞24h后诱导细胞凋亡的情况;Western Blot检测经Mel菌25CFU/细胞、对照组X4550菌45CFU/细胞和对照组GFP菌30CFU/细胞作用24h后的小鼠结肠癌CT-26细胞线粒体通路中Caspase-9,Caspase-3和PARP的蛋白水平。结果:MTT结果显示各组菌均能够有效抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的生长,随着浓度的增大和作用时间的延长,抑制率逐渐增高,趋近100%,当Mel菌浓度为25CFU/细胞时,抑制率为50.26%,当X4550菌浓度为45CFU/细胞时,抑制率为50.12%,,当GFP菌浓度为30CFU/细胞时,抑制率为50.02%,作用时间均为24h,与对照组相比差异显著(P<0.01)。Transwell小室实验结果显示,经25CFU/细胞Mel菌处理24h后的CT-26细胞穿膜数为41.8个,较对照组161.8个明显减少并呈一定的浓度依赖性(P<0.01)。细胞凋亡检测结果显示,经25CFU/细胞Mel菌处理24h后的小鼠结肠癌CT-26细胞凋亡率为13.98%,较对照组5.73%明显提高并呈一定的浓度依赖性(P<0.01)。Western Blot结果显示,经25CFU/细胞Mel菌处理小鼠结肠癌CT-26细胞24h后,细胞上清中,Caspase-9,Caspase-3和PARP的相对表达量分别为0.43、0.37、0.44,较对照组1.91、1.3、2.2明显降低,呈一定的浓度依赖性(P值均<0.01)。结论:携带蜂毒素基因的减毒沙门氏菌(Mel菌)具有天然蜂毒素的活性,当其浓度为25CFU/细胞,作用小鼠结肠癌CT-26细胞24h后,就能明显抑制细胞的增殖、迁移、并诱导细胞凋亡,其机制可能与下调Caspase-9,Caspase-3和PARP蛋白水平直接相关。第三部分携带蜂毒素基因的减毒沙门氏菌治疗小鼠结肠癌CT-26细胞移植瘤小鼠模型的实验研究目的:观察携带蜂毒素基因的减毒沙门氏菌治疗小鼠结肠癌CT-26细胞移植瘤小鼠模型的效果。方法:60只BALB/c小鼠购回后适应性饲养1周,除正常组外,所有小鼠以右侧腋窝皮下注射小鼠结肠癌CT-26细胞悬液浓度为3x106/0.1ml/鼠的方法诱导制作小鼠结肠癌CT-26细胞移植瘤小鼠模型。细胞悬液注射后,每天检查小鼠右侧腋下,有肿大质硬的肿块,确定造模成功。按随机数字法将其分为模型组,对照组X4550菌组,对照组GFP菌组,Mel菌组,阳性药物人参皂苷对照组(Rg3)。成瘤后每3天细菌组(X4550菌组、GFP菌组、Mel菌组)分别给小鼠灌胃,1 × 106CFU/0.2ml/鼠;Rg3组每日灌胃Rg3,剂量是0.1mg/kg/0.2ml/鼠;正常组及模型组均灌胃,0.2ml/鼠生理盐水,每3天灌胃后测量小鼠体质量、测量肿瘤长和宽、记录小鼠一般情况。给药4周后,于末次给药12h后摘眼球取血法收集血样,ELISA法检测相关因子(IL-2、IL-6、IL-10、VEGF、IFN-γ):RT-PCR检测小鼠肿瘤组织中VEGF、KDR和p53 mRNA的表达。结果:肉眼观察可见,除正常组外,其他各组小鼠均成功荷瘤,通过小鼠肿瘤测量计算体积比较后发现,给药组小鼠的肿瘤体积均得到缓解,其中Mel菌组小鼠肿瘤体积增长程度慢于其他组(P<0.01);ELISA检测小鼠血清中IL-2、IL-6、IL-10、VEGF、IFN-γ等细胞因子发现,Mel菌组小鼠各项免疫学指标改变优于其他组(P<0.01);各治疗组与模型组相比较,VEGF、KDR mRNA基因的相对表达量下调(P<0.01),p53mRNA基因相对表达量上调,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:携带蜂毒素基因的减毒沙门氏菌具有天然蜂毒素的活性,能有效缓解荷瘤小鼠肿瘤的生长,通过调控IL-2、IL-6、IL-10、VEGF、IFN-y等细胞因子的表达及抑制VEGF/KDR通路中关键信号分子的激活和激活抑癌基因p53的表达来达到抑制肿瘤生长。